赵海涛，毛一雷，黄洁夫
中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肝脏外科，北京100730

        本研究在国家自然科学基金（30600729）、北京协和医院青年基金（2005 37A）、CMB项目： No. 06837资助下完成。

        大多数肝细胞肝癌，特别是伴发肝硬化和其它一些症状的情况下，预后往往都很差。外科手术，包括肿瘤切除术或是肝移植，往往是肝癌治疗的唯一手段。化疗和肿瘤栓塞术只能缓解症状，对存活率和存活时间没有显著改善[1]。因此，寻找肝癌手术后预防转移和复发的手段，成为肝癌治疗的重要研究方向。

I．肝细胞癌的免疫应答及其对肝癌预后的影响

        尽管大多数肝癌病人的预后不好，但越来越多的证据表明，免疫应答至少在部分肝癌病人中，对疾病的进展乃至病人的存活至关重要。

1.T淋巴细胞:

（1）CD8+ T细胞对肝癌细胞具有特异性识别杀伤作用：

        较早的研究表明，与大量无T淋巴细胞的样本相比，有T淋巴细胞浸润的小肝癌的复发率低、5年生存率高。而且占优势的浸润淋巴细胞为CD8+的T淋巴细胞，而非CD4+的T淋巴细胞[2]。随后，在肝癌组织中发现了特异性识别多种肿瘤相关抗原包括肿瘤特异性共享抗原[3,4,5]、自体抗原（AFP[6]和SART-1[7]）、病毒表位[8,9]的T细胞。CD8+ T细胞的浸润与肝癌细胞的凋亡呈正相关[10]。我们自己的工作证明，肝癌组织浸润的CD8+ T细胞，在体外经过活化后，具有杀伤自身肝癌细胞的功能。不仅如此，在晚期肝癌病人的外周血淋巴细胞中，也存在可以识别自体肝癌细胞的CD8+ T淋巴细胞（未发表数据）。

（2）CD8+ T细胞可特异性识别杀伤具有干细胞特征的肿瘤细胞

        肿瘤干细胞被发现普遍存在于包括肝癌[11,12]在内的多种恶性肿瘤组织中，并被认为是肿瘤常规治疗后复发和转移的直接原因[13]。而另一方面，肿瘤干细胞虽然对如放化疗等常规治疗手段不敏感，但它们可有效诱导免疫应答，从而作为免疫治疗的靶点 [14]。最新的研究表明，多发性骨髓瘤（MM）的癌前病变MGUS常常表达胚胎干细胞参与自我更新的关键分子SOX2。而识别该分子特异性T细胞的存在提示癌前病变的良好预后[15]。我们最近建立的一株干细胞样肝癌细胞系中，发现该株细胞表达大量肿瘤特异性共享抗原，同时可被来源于同一病人自身的CD8+ T细胞特异性杀伤。这提示我们通过利用免疫治疗杀伤肿瘤干细胞，可能达到控制肿瘤复发和转移的目的。

（3）辅助性CD4+ T细胞对移植后肝癌的复发有抑制作用

        有文献表明，肝癌患者进行肝移植后，肝癌复发的危险率与CD4：CD8的比例呈正相关，但此种CD4+ T细胞为辅助性T细胞，而不是表达CD25分子的调节性T细胞（regulatory T cells）[16]。

（4）CD4+CD25+调节性T细胞可通过抑制CD8+ T细胞的作用促进肝癌细胞生长

        存在于肿瘤边缘位置及肿瘤浸润性调节性CD4+CD25+T细胞具有抑制肿瘤特异性CD8+ T细胞增殖和活化的作用，成为肝癌细胞不受控制生长的原因之一[17]。此外，在肝癌病人的外周血中，其CD4+CD25+调节性T细胞也明显增加，并于肿瘤局部CD4+CD25+调节性T细胞的浸润呈正相关。这些调节性T细胞在体外与非调节性T细胞共同培养时，抑制后者的增殖和细胞因子的分泌[18]。

2.细胞因子：

        细胞因子是调节机体天然免疫和获得性免疫的关键因子。细胞因子环境的平衡对获得保护性免疫（如抗病毒，抗肿瘤，抗细菌免疫）及避免病理性免疫（如自身免疫病）至关重要。一般来讲，Th1 类细胞因子有利于抗肿瘤免疫，而Th2类细胞因子可能有抑制肿瘤免疫的作用。Budhu A等人[19]最近报道，肝癌的局部转移与局部组织的细胞因子为环境直接相关。相比于不利于肝内静脉转移的微环境（MAM），趋于肝内静脉转移的微环境中的细胞因子标签出人意料地高表达Th2类细胞因子IL-4, IL-5, IL-8和IL-10，而明显低表达Th1类细胞因子，包括IL-1A, IL-1B, IL-2, IFN-?和 TNF。在利用细胞因子进行的肿瘤治疗试验中，有证据表明，在作为细胞因子配合疫苗使用时，Th1类细胞因子，包括IL-2，-7，-12，-18，IFN-?，TNF-?及部分Th2 类细胞因子，包括IL-4，IL-6，可诱导抗肿瘤抗原特异性的免疫应答[20]。在直接使用细胞因子进行恶性肿瘤的治疗中，IL-2 和IFN-?，-?应用得最为广泛[20]。而在评价抗肿瘤免疫中，T细胞在识别肿瘤细胞后分泌IFN-?的量成为评价抗肿瘤免疫应答的最重要指标之一[21]。

II．肝癌免疫治疗策略：

        针对肝癌免疫应答的上述特性，适当的免疫治疗方法有可能通过杀伤肿瘤细胞，包括肿瘤干细胞的方式，达到控制肝癌复发和转移的目的。这需要解决两方面的问题（1）有识别肝癌细胞的特异性杀伤性T细胞；（2）能够改善患者体内免疫环境和免疫微环境，使控制和杀伤肿瘤细胞的免疫细胞能够发挥功能。这包括降低CD4+CD25+调节性T细胞的数量，并使Th1/Th2细胞因子水平向Th1平衡。

        肿瘤的免疫治疗，主要包括两个大的方面。包括主动免疫治疗和被动免疫治疗。

1.主动免疫治疗：

        主动免疫治疗以肿瘤疫苗为代表，是通过调动机体自身免疫系统，诱导机体内部产生抗肿瘤免疫细胞、免疫分子，发挥抗肿瘤作用的治疗方法。其研究基础是肿瘤表达与正常细胞不同的分子细胞成分，即肿瘤抗原。自1991 年Van der Bruggen 等人[22]首次发现了人类肿瘤免疫排斥抗原 （特异性肿瘤共享抗原）- MAGE - 1后，此类肿瘤抗原基因，包括MAGE-1，-3，NY-ESO-1，LAGE-1，CT7，CT10等数十种肿瘤抗原基因，在包括肝癌在内的多种不同肿瘤中均有表达[23]。同时，肝癌细胞还表达大量其它肿瘤相关性抗原，可以作为免疫治疗的靶点[24]。如果能够成功地使用这些抗原免疫病人，将有超过90%的肝癌患者可能受益。除此之外，部分肝癌细胞高表达AFP，AFP作为抗原成分的疫苗显示在肝癌病人体内可以诱导AFP特异性的免疫应答[25]，同时由于肝癌病人往往伴随着HBV和/或HCV的感染，因此，利用HBV或HCV病毒抗原进行肝癌治疗性疫苗的研究也是肝癌疫苗研究的重要方向[26，27] 。

2.被动免疫治疗：

        被动免疫治疗是指通过体外操作，直接给予机体抗肿瘤免疫细胞或免疫分子，使机体立即获得抗肿瘤免疫能力的方法，包括过继性细胞免疫治疗和抗体靶向治疗。

（1）过继性细胞免疫治疗：

        细胞过继免疫治疗，是通过离体扩增病人自身特异性或非特异性淋巴细胞、扩增并回输的过程，来满足上述条件，达到杀伤和/或控制肿瘤细胞的目的。这种方法建立于T细胞活化分子白细胞介素2 (IL-2)的发现，包括肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）方法，LAK（Lymphokine-induced Killer）细胞、CIK （Cytokine-induced Killer）细胞和EAAL。这些方法最主要的不同在于培养前所使用的细胞、培养后所获得的细胞种类不同、培养效率和临床效果不同（表1）。

表1. 不同细胞过继免疫治疗方法的比较

PBMC：外周血单个核细胞
ND：未检测
*使用单个核细胞采集机分离病人相当于此体积的PBMC。

        二十世纪八十年代，Steven Rosenberg等开始在体内或体外利用IL-2刺激机体的T淋巴细胞，治疗转移的恶性黑色素瘤（恶黑）和肾癌。在早期的研究中，大剂量IL-2直接给予病人。在对567名恶黑患者的临床试验研究中，21％的病人有临床效果[28]。然而，大剂量IL-2的治疗同时带来了严重的副作用，包括肾衰、严重的口炎和全身反应等。2002年，Rosenberg等报道了一种新的细胞过继回输方法，进行肿瘤的免疫治疗[29]。他们在体外筛选出具有病人自身恶黑细胞特异性杀伤作用的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），大量扩增后回输给自体病人。在这种方法中，经过体外IL-2和抗CD3抗体的联合作用，数量高达1011的肿瘤细胞高度特异的TILs被回输至病人体内，这些细胞以CD3+、CD8+、CD56+的T细胞的为主。在接受治疗的13例病人中，6例病人完全缓解，4例病人部分缓解。这10例病人均发生明显的肿瘤缩小和/或消失。这个报道，重新燃起了免疫学家和临床医生对细胞过继治疗肿瘤的热情。然而，TIL过继回输的方法在很大程度上受到肿瘤细胞原代培养的成功率、肿瘤特异性浸润细胞的可获得性、体外扩增能力、体外培养后特异性和功能的可维持性的限制。因此，这个方法长期以来难以在临床实施推广。最近，同样是Rosenberg SA的研究室发表了一种新的肿瘤特异性细胞免疫治疗方法[30]。该方法利用已知识别肿瘤抗原的T细胞受体（TCR）基因转染具有同样HLA分子的患者外周血单个核细胞的方法，将肿瘤特异性引入病人外周血细胞后，体外扩增回输给病人，为肿瘤特异性细胞免疫治疗提供了一种新的途径。

        最近，在传统的抗CD3抗体和IL-2体外扩增活化淋巴细胞方法的基础上，日本国立癌症研究院关根晖彬（Teruaki Sekine）博士开发了一种新的肿瘤免疫治疗的方法---扩增活化的自体淋巴细胞（Expanded Autologou Activated Lymphocytes，EAAL)。在这种新的方法中，使用的淋巴细胞来源于病人自身的少量外周血（20-100ml）。在约2周的短时间内，这些淋巴细胞可以活化扩增达1000倍。其主要细胞成分包括（1）CD3＋CD56＋（约10％）细胞，它们既具有自然杀伤细胞特征、又具有T淋巴细胞特征的细胞群体；（2）CD8+的杀伤性T淋巴细胞（约50 - 70％）；（3）NK细胞（约10%）。CD3+、CD56+细胞中的一部分可识别在部分肿瘤细胞中改变的糖类抗原；CD8+ T淋巴细胞为机体最主要的抗肿瘤淋巴细胞群体，其中可有识别多种不同肿瘤抗原/病毒抗原的特异性杀伤性T细胞，对肿瘤细胞或病毒进行杀伤；NK细胞对HLA表达下调的肿瘤细胞有直接的杀伤作用。同时，在经过活化扩增的淋巴细胞群体中，CD4+CD25+调节性T细胞的含量很少，平均约为1.7%（外周血调节性T细胞的百分率约3-5%）（未发表数据）。在一项历经约10年的大规模随机临床试验中，经过EAAL治疗的肝癌术后患者，与不经该治疗的对照组相比，肝癌术后复发率降低18%(p=0.008)，复发的危险率减少了41％[31]。此外，初步的数据显示，该方法对于恶性脑肿瘤及其它一些肿瘤具有一定的预防复发和转移、延长病人生存期的效果[32-35]。根据这些结果，2007年韩国FDA批准了EAAL作为新药应用于肝癌病人的临床治疗，使EAAL方法成为国际上第一例由政府医药管理机构批准的肿瘤细胞免疫治疗方法。

（2）抗体靶向治疗：

        抗体靶向治疗包括：[36]①抗肿瘤单克隆抗体直接体内应用；②抗肿瘤单克隆抗体与抗肿瘤药物、生物毒素、细胞因子或同位素偶联，通过抗肿瘤单抗将效应分子引导至肿瘤局部，杀伤肿瘤；利用肝癌特异性单克隆抗体，将方设性同位素、抗肿瘤药物、免疫毒素“弹头”与其连接，特异性提高肝癌局部浓度，期望提高治疗效果。③抗肿瘤单克隆抗体和抗效应细胞表面分子的抗体组成双特异性抗体，可引导杀瘤效应细胞向肿瘤灶集中，增强局部抗肿瘤效应。目前应用于肝癌治疗的抗体以贝伐单抗为代表。它是一种重组人源化抗VEGF的单克隆抗体，通过与循环中VEGF的竞争性结合，阻止VEGF与相应受体结合，进而阻止肿瘤新生血管的发生。另外，贝伐单抗使肿瘤及其周围组织的血管分布正常化，因此可通过降低肿瘤组织间质压而有利于化疗药物的传递。

        Schwartz等[37]于2005年美国临床肿瘤学会年会上报告的一项Ⅰ期临床试验结果显示，收治的24例晚期肝癌患者接受贝伐单抗单药治疗后，2例临床部分缓解，17例肿瘤稳定>4个月，所有入组患者的中位TTP为6.4个月。Zhu等于[38]2006年完成并在Am J Clin Oncol上发表的一项Ⅱ期临床试验，对30例晚期肝细胞癌患者给予贝伐单抗联合吉西他滨与奥沙利铂(GEMOX-B方案)治疗。结果显示，入组患者经GEMOX-B方案治疗后缓解率约为20%，另有27%的患者肿瘤稳定，故总有效率约达50%。所有入组患者的中位生存期为9.6个月，中位疾病无进展生存期(PFS)为5.3个月，3个月与6个月时的疾病无进展率分别为70%与48%。GEMOX-B方案治疗后最常见的Ⅲ/Ⅳ度不良反应为疲乏、高血压、白细胞减低及短暂的转氨酶升高。

        肿瘤的免疫治疗基础，是机体的免疫系统具有监视和杀伤肿瘤细胞的能力。在临床上，肿瘤的自发性消退虽不常见，但的确存在。相比较于化疗和放射治疗，肿瘤免疫治疗具有特异性高，副作用小的特点。理论上来说，每一位肿瘤病人都可从免疫治疗中获得益处，并且早期病人由于机体免疫系统尚未受到肿瘤的严重影响，对免疫治疗的应答较好，疗效相对也会加强。而目前免疫治疗的对象往往是晚期无法进行其它治疗的病人。即使在这些病人群体中，免疫治疗所显现的疗效，已足以使其成为继手术、放化疗之后的第四种肿瘤治疗手段。

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