毛一雷，张涛，桑新亭，卢欣，杨志英，钟守先，黄洁夫

中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院 肝脏外科，北京 100730

[摘要]目的：建立新西兰白兔的肝纤维化合并肝癌模型，为进一步研究提供较大型动物模型基础。方法：32只新西兰白兔随机分为2组，每组16只。模型组给予CCl4油溶液灌胃，每周2次，共8周，第6周末肝脏接种VX-2肿瘤；对照组陪同饲养。观察实验兔的一般情况、体重变化、肝功能变化情况，并行CT及B超影像学检查和病理学检查。结果：模型组共存活11只。与对照组相比，模型组体重下降，血清ALT、AST、GGT、TBil升高，血清ALB、A/G下降，CT和B超发现肝脏占位，病理检查证实模型组新西兰白兔出现肝纤维化肝癌。结论：本研究使用CCl4灌胃法诱发新西兰白兔肝纤维化，并种植肝脏VX-2肿瘤，这是国内外首次在较大型动物新西兰白兔上完成的肝纤维化肝癌的模型。

关键词：肝癌 肝纤维化 动物模型 肝硬化

Establishment of an Animal Model of Hepatic Fibrosis Combined with Hepatic Carcinoma in New Zealand White Rabbit
MAO Yi-lei，ZHANG Tao，SANG Xin-ting，LU Xin，YANG Zhi-yin，ZHONG Shou-xian，HUANG Jie-fu
（Department of Liver Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China）
Corresponding author: MAO Yi-lei

[Abstract] Objective: To establish an animal model of hepatic fibrosis combined with hepatic carcinoma in New Zealand white rabbits in order to provide a large animal model for further researches. Methods：Thirty-two New Zealand white rabbits were divided randomly into two groups of the Model Group (n=16) and the Control Group (n=16). CCl4 diluted in oil was given to the animals in the Model Group twice a week for eight weeks. VX-2 tumor was implanted in the liver at the end of the sixth week. The Control Group was fed normally as companions. The general condition, body weight changes, and liver function were observed, and CT scan, ultrasound, and histopathological examinations were performed for all the animals. Results: Eleven rabbits in the Model Group survived. Compared to the Control Group, the body weight, plasma ALB, A/G decreased significantly, while plasma ALT, AST, GGT, TBil increased markedly in the Model Group. Neoplasm was found in the Model Group by CT scan and ultrasound. The hepatic fibrosis combined with hepatic carcinoma was proven in the rabbits of the Model Group by histopathological examinations. Conclusion：This animal model is the first one of hepatic fibrosis with implanted VX-2 liver cancer in New Zealand white rabbits internationally and domestically.

Key words: liver cancer; hepatic fibrosis; animal model; liver cirrhosis

肝硬化继发肝癌患者在中国为数众多，是肝外科治疗的重中之重，而相关的动物模型是一些重要研究的基础。现已建立的大鼠肝硬化肝癌模型由于动物体积小[1,2,3]，限制了其在一些研究中的应用，较大型动物的肝纤维化合并肝癌模型在国内外尚属空白。本研究结合国内外资料并进行改进，使用四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4）诱发新西兰白兔肝纤维化，并种植VX-2肿瘤，首次建立了新西兰白兔肝纤维化肝癌模型。此研究是建立单光子发射型计算机断层显像术前三维肝功能评估系列研究中的第一部分[4,5]。

材料与方法

一、材料

1、实验动物
雌性新西兰白兔，32只，体重2.0 kg～2.5kg，由北京富豪实验动物养殖中心（许可证号：SCXK(京)2000-0019）和北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2005-0002）提供，饲养于中国医学科学院北京协和医院实验动物室(许可证号：SYXK（京）2005-0008)，动物实验环境为普通环境。实验动物分笼饲养，实验前适应性喂养1周。饲养房温度20°C～22°C，相对湿度40 %～70 %，每日12小时仿日光灯照，饲料采用家兔全价颗粒饲料（北京科澳协力饲料有限公司，京动许字（2000）第015号），每日定时喂食，允许随时自由饮用清水。

2、药品与器材
手术器械由中国医学科学院北京协和医院肝脏外科和实验动物室提供。CCl4：优级纯，购自北京化学试剂公司，批号：050314，按1:1体积比与大豆油混匀制备50%四氯化碳油溶液。速眠新II注射液：购自北京三元集团畜牧兽医总站，吉兽药试字（2004）005013，由军事医学科学院军事兽医研究所试制。RPMI 1640：购自GIBCO公司，批号：31800-014，10.4g加2克NaHCO3溶于1L蒸馏水中，灭菌后备用。

3、VX-2荷瘤兔及肿瘤块的准备
VX-2瘤株购自中国人民解放军总医院。将瘤株接种于兔腹股沟区皮下，3周左右将兔麻醉后无菌条件下剥离肿瘤，切开瘤体取靠近包膜的灰白色鱼肉样质硬组织置于RPMI 1640中，剔除坏死组织及纤维组织，将瘤组织剪碎至1mm3左右的小块组织，取部分组织接种于兔腹股沟区皮下制备荷瘤兔并传代，其余组织备用[6]。

二、实验分组

将32只新西兰白兔随机分为2组：
模型组（n＝16）：给予CCl4油溶液灌胃共8周，第6周末接种VX-2肿瘤。
对照组（n＝16）：陪同饲养，不进行灌胃和肿瘤接种。

三、方法

1、模型组灌胃与种植肿瘤：模型组新西兰白兔于8:00AM～10:00AM给予50% CCl4油溶液0.2ml/kg灌胃，每周2次，共8周。第6周末肝脏接种VX-2肿瘤：术前12h内禁食不禁饮，速眠新II注射液0.3ml/kg肌注麻醉，麻醉生效后将实验兔仰卧固定于兔板，上腹部剃毛，按外科无菌程序消毒术区皮肤，铺无菌巾，于剑突下1 cm 处沿腹白线作一长2cm～3cm 的正中切口，逐层入腹暴露肝脏，用眼科镊向右肝实质中央插入0.5 cm，形成直径为2mm～3mm 的隧道，取备用的VX-2肿瘤组织1块植入隧道底部，压迫止血，用直径1cm的明胶海绵覆盖，彻底止血，分层缝合切口。术闭肌注青霉素钠40万单位[6,7]。

2、模型检测项目：
（1）新西兰白兔的一般情况及体重变化：观察实验兔的进食、活动、毛发等情况，每周测量体重。
（2）血清学肝功能检测： 第0、1、3、5、7、9周时经新西兰白兔耳动脉取血，送北京协和医院检验科生化实验室，血样经3000转/秒离心5min后取血清，于Olympus AU2700全自动生化分析仪上检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ－谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素（TBil）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、胆碱脂酶（CHE）和白球比（A/G）。
（3）影像学检查：第9周时行肝脏CT（Somatom Sensation 16，Siemens）和B超（iU22型彩色超声诊断仪，Philips）检查，观察肝脏的形态和肿瘤生长情况。
（4）新西兰白兔肝脏大体标本检查和病理学检查：在CCl4灌胃的第3周、第6周以及第9周完成模型时分别处死实验兔，开腹取出肝脏组织，观察肝脏与肿瘤组织。将第9周的肝脏标本行HE染色、网织染色、Masson染色于光镜下观察。

四、统计学方法
应用SPSS 12.0 for Windows（SPSS Inc.，USA）进行统计分析，实验数据以 表示，显著性检验采用t检验，以P<0.05表示差异有显著性。

结果

1、一般情况
对照组全部存活，模型组存活11只，存活率68.8%。模型组新西兰白兔均出现不同程度的进食差、体重下降、活动减少、毛发稀疏等，程度重者常至死亡。濒死动物极度消瘦，精神萎靡，拒饮拒食。尸体检查或完成模型后发现大部分模型组家兔腹腔内有一定量的腹水。对照组新西兰白兔进食、活动好，体重逐渐升高。两组体重变化有显著差异（P<0.05）（表1）。

2、血清学肝功能检测结果
建立模型前（第0周）模型组与对照组肝功能指标TP、ALB、TBil、ALT、AST、GGT、CHE和A/G均无显著性差异（P>0.05），证明模型组与对照组属于随机分组；模型建立后（第9周），模型组ALB和A/G水平下降，TBil、ALT、GGT水平升高，与对照组相比具有显著性差异（P<0.05），模型组TP和CHE水平较对照组有下降趋势，而AST水平有升高趋势（P>0.05）（表2）。第1、3、5、7、9周肝功能动态检测结果发现，模型组ALT、GGT始终显著高于对照组（P<0.05）；模型组AST虽高于对照组，但仅在第3周和第5周有显著意义（P<0.05）。模型组ALB、CHE在第1至9周均低于对照组，而TBil高于对照组。模型组A/G从第1周至第9周均显著低于对照组（P<0.05）（图1ABCD）。

3、影像学检查结果
CT平扫可见肿瘤在肝脏内呈结节状低密度灶，直径约1.0cm～1.5cm；增强后肿瘤组织不均匀强化，与周围肝脏组织分界清晰，中心坏死区无强化(图2)。B超检查可见肝脏上高回声占位病灶，直径约1.0cm～1.5cm，与周围组织分界清晰（图3）。

4、病理结果
分别在第3周、第6周及第9周处死实验兔并剖腹检查，与对照组新西兰白兔相比，模型组第3周和第6周肝脏略大、褐色、质稍脆；模型组第9周新西兰白兔肝脏增大、暗褐色、质韧，存活的新西兰白兔均可见肿瘤在肝实质内呈结节状，直径约1.0cm～1.5cm，灰白色鱼肉样，无包膜，质硬(图4)。光镜：肝脏可见肝小叶结构破坏，纤维组织增生，分隔肝细胞，有假小叶形成趋势。肝内肿瘤组织呈浸润性，与肝实质无明显边界，血窦丰富，结缔组织较少，肿瘤细胞弥散排列，可见纤维间隔。高倍镜下见瘤细胞体积大，排列不规则。胞浆丰富，核大，呈异型性，核分裂像多见（图5）。模型组新西兰白兔经病理检查证实均形成肝纤维化肝癌。

讨论

在肝硬化肝癌的研究中，有些需要较大型的动物模型，但是目前仅有大鼠的肝硬化肝癌模型[1,2,3]，较大型动物模型尚属空白。本研究建立了新西兰白兔的肝纤维化肝癌模型，此模型是作者进行的术前三维肝功能评估系列研究中的一部分[4,5]。本研究结合国内外资料并进行改进，使用CCl4灌胃法诱发新西兰白兔肝纤维化，并种植肝脏VX-2肿瘤，这是国内外首次在较大型动物家兔上完成的肝纤维化肝癌的模型。本模型建立在8周内完成，死亡率68.8%，存活动物100%出现肝纤维化肝癌。

选择新西兰白兔是因为其体积中等，肝脏大小适中，可以行肝脏切除或影像学检查，而更大型的动物存在价格昂贵、操作不便等众多缺点。我们使用CCl4诱发肝纤维化，因为在即往的研究[8,9,10]以及预实验中都证明CCl4可引起新西兰白兔的肝纤维化，作用效果好，纤维化形成稳定；给药方式选择CCl4灌胃法的优点在于CCl4可以直接经门静脉到达肝脏，使得其对肝脏的毒性更直接、迅速和专一[10]。VX-2肿瘤是由Shope病毒在兔皮肤上诱发而产生的乳头状瘤，经数十次传代后仍可在兔体内移植的转移性肿瘤。它是一种可移植的瘤株，可以接种到兔的肝脏、肾脏、肌肉等组织器官内，制成原位肿瘤动物模型。文献报道其种植于肝脏类似人类肝细胞肝癌[6,7]。

模型建立过程中，对照组体重逐渐升高，而模型组体重下降、活动减少、毛发稀疏，甚至死亡。值得注意的是，本模型的建立在起始阶段并不容易，预实验中模型动物存活率较低，仅30%左右，这与CCl4剂量、麻醉、灌胃操作、手术种植肿瘤等有关。通过预实验的摸索，笔者发现给予50% CCl4油溶液0.2ml/kg灌胃，每周2次共8周可以获得稳定的肝纤维化模型，并使死亡率降至最低；选择第6周末种植VX-2肿瘤可以使肿瘤足够大，却并不发生局部扩散和远处转移；此外，熟练灌胃操作、改进种植肿瘤手术技巧，能使存活率得以逐步升高。

模型建立后（第9周）模型组血清ALB和A/G水平下降，TBil、ALT、GGT水平升高，与对照组相比具有显著性差异。根据肝功能动态变化可知，ALT、AST、GGT迅速上升达高峰后逐渐下降，ALT、AST峰值出现在第1周，GGT峰值出现在第3周。CCl4诱发新西兰白兔肝纤维化主要是通过引起中毒性肝炎，长期肝炎逐渐诱发肝脏的纤维增生，形成肝纤维化，损伤肝脏功能[11]。模型组ALB、A/G降低、TBil升高说明肝脏功能逐渐受损，引起蛋白合成功能以及胆红素代谢功能异常。综上所述，模型组ALT、AST、GGT、TBil、ALB、A/G的变化均类似于人类的肝硬化时的表现。此外，大部分模型兔出现腹水，进一步证明了模型兔出现肝纤维化、肝功能受损。在预实验中笔者还检测了凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶原时间（APTT）、纤维蛋白原（FbgC）、血氨等指标，但在采血过程中，常规抗凝无法满足新西兰白兔血液标本的抗凝需要而常出现凝血，因此，无法对比分析此四项指标。

通过B超和CT影像学检查我们可以证实该模型中的肝脏占位性病变。该占位性病变生长旺盛，中心常常出现液化坏死，类似于人类的原发性肝癌。但是通过B超和CT影像学检查，尚无法确定有无肝脏纤维化。

本动物模型通过病理检查最终证实了肝纤维化肝癌。模型组存活的实验兔肝脏略大、暗褐色、质韧，均可见肿瘤在肝实质内呈结节状。光镜下可见肝小叶结构破坏，纤维组织增生，分隔肝细胞，有假小叶形成趋势，肝内肿瘤组织呈浸润性生长。VX-2肿瘤为富血供肿瘤，其供血动脉主要为肝动脉，类似于人类的原发性肝细胞癌[6]。而人类的肝硬化是肝细胞坏死基础上纤维化，并代之以纤维包绕的异常肝细胞结节（假小叶）。本研究建立的模型中肝小叶结构破坏，肝脏纤维组织增生，有假小叶形成趋势，已经形成了肝纤维化，并向肝硬化方向发展；与人类的慢性肝炎发生肝纤维化并向肝硬化方向发展相似。在建立动物模型中我们无法完成与人体内经过数年形成的肝硬化完全相同的结果，也无法模仿人类肝炎病毒感染而进一步演化的肝脏病理改变，但在本研究中，此模型已经在肝功能检测、病理检查方面与人类的肝硬化非常相似，可以进行进一步研究。

综上所述，本研究建立的新西兰白兔肝纤维化肝癌模型与人类的肝硬化肝癌非常相似，可以用于肝硬化肝癌治疗方面的研究，如肝切除手术。我们正在建立的单光子发射型计算机断层显像术前三维肝功能评估系统便需要应用该动物模型完成临床前的部分研究。除此之外，该动物模型还可能会在肝硬化肝癌的研究领域中有一定的应用前景。

致谢

感谢北京协和医院病理科梁智勇医师、王德田医师、张淑英医师以及超声科吕珂医师、放射科王?V医师的帮助，感谢北京协和医院实验动物室马斯骥、张栋、郁佩华各位同事的帮助。

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