毛一雷，于卓，桑新亭，卢欣，钟守先

摘 要
目的 观察阿托伐他汀及细胞因子阻断剂AG490对极限肝切除术后大鼠剩余肝细胞功能和存活率的作用。 方法 在标准90%肝切除后，大鼠随机分为3组，对照组不用任何药物；Ator组术前1天至术后3天胃管内注入阿托伐他汀（20mg/kg）；AG490组术中至术后36h内每隔12h腹腔内注射AG490 （1mg/kg），观察术后生存及肝再生情况。 结果 对照组大鼠24 h内100％死亡， 术后48 h内肝脏增生不足以代偿其功能。阿托伐他汀和AG490均明显地延长了90%肝切除术后大鼠的生存时间（25.6 h和30.6 h vs. 10.7 h，p<0.05），尤以AG490效果显著。 结论 细胞因子阻断剂和阿托伐他汀能显著延长极限肝切除术后大鼠的生存时间，为重大肝手术患者术后保护肝功能提供了一定的理论依据。

关键词：肝切除；爆发性肝衰竭；平均存活时间；阿托伐他汀；AG490

基金项目：美国Li-Foundation Heritage Prize 基金
作者单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院 肝脏外科中心
北京，100730
通讯作者：毛一雷

A Research on Approaches That Increase the Survival Time
Following Extensive Liver Resection in Rat

Yilei MAO, Zhuo YU, Xinting SANG, Xin LU，Shouxian ZHONG

( Corresponding author: Yilei MAO, E-mail: maoy@public3.bta.net.cn )
Abstract
Objective to observe the effects of atorvastatin and cytokine signaling inhibitor AG490on the residual liver function and the survival time of extensively liver resected rats. Methods Rats were divided randomly into three groups after surgery: Ctrl Group, without treatment; Ator Group, administrated with atorvastatin (20mg•kg-1•d-1) through NG tube, one day before and three days after the surgery; AG490 Group, given AG490 (1mg•kg-1•12h-1) intraperitoneally, immediately and through 36 hours after the operation. The survival situation and the liver regeneration of the rats were observed and recorded. Results The rats in the Ctrl Group had 100% death rate within 24 hours. During the first 48 hours postoperatively, the remaining liver had started regeneration, which, however, was insufficient to compensate its function. Both atorvastatin and AG490 significantly increase the survival time of rats after surgery (25.6 h & 30.6 h vs. 10.7 h，p<0.05), especially did the latter. Conclusions It is the first report domestically and internationally to describe the cytokine signaling inhibitor and atorvastatin significantly prolonged the survival time of rats following extensive liver resection. This result implies the theoretical basis of clinical application of certain medications in the future.

Key Words: Hepatectomy; Fulminating Liver Failure; Mean survival time; Atorvastatin; AG490

Supported by：Li-Foundation Heritage Prize foundation, USA
Corresponding author：Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Peking Union Medical College Hospital, Liver Surgery Center, Beijing, 100730
Email：maoy@public3.bta.net.cn

极限肝切除术后患者死亡率高，如何保护肝功能、增加存活率已成为肝脏外科中一个重要的课题。研究发现，P21-RAS蛋白在肝切除术后特异性地抑制肝细胞的功能[1]­。HMGCoA还原酶抑制剂（他汀类）能阻断P21-RAS的信号传递，从而促进肝细胞功能[2]。重大手术包括扩大肝切除能引起过度炎症反应[3]，造成局部和全身组织损害。本实验设计应用了Jak-2激酶的特异阻滞剂AG490[4]来对抗过度炎症反应。这种通过阻断炎症介质来保护剩余肝细胞免受损害、改善术后存活率的方法是一个尚未被研究的概念。
本研究用大鼠90%肝切除的模型，在国际、国内首先探明了阿托伐他汀和AG490对术后存活情况的作用。

材料与方法
1．实验动物
Sprague-Dawley雄性大鼠，体重220～270g，由中国医学科学院实验动物中心提供。动物在控制温度、湿度及12h照明与12h黑暗交替的环境中饲养，允许随时自由食用固定标准饲料和清水。
2．药品与器材
手术器械由北京协和医院外科和动物中心提供。
AG490购自Calbiochem公司(San Diego, CA, USA)，每5mg用5ml DMSO-15ml ddH2O充分溶解，每次注射1mg/kg BW。
阿托伐他汀（Atorvastatin，10mg/片）（Pfizer，Beijing Branch，China）研磨至粉末状，用0.9%生理盐水溶解成均匀的悬浊液，每次给20mg/kg BW。
3．实验分组
（1）肝切除手术的大鼠（n＝42）随机分为3组。Ctrl组（n=10）：术前1d胃管予0.9%生理盐水1.5ml，术后即时及术后1、2、3d各给1次。AG490组（n=16）：术后即时及术后12、24、36h各腹腔内注射AG490溶液1ml。Ator组（n=16）：术前1d胃管予阿托伐他汀悬浊液1.5ml，术后即时及术后1、2、3d各给1次。
（2）另设正常对照大鼠组（n＝10），分别测每日体重增长量和肝脏占体重的百分数。
4．手术处理
大鼠90％肝切除：根据Emond等[5]的方法进行改良。上腹部正中切口，用丝线分别结扎外侧叶、中叶、右下叶及右上叶，并予切除。观察剩下的尾状叶无淤血后关腹。
5．检测内容
（1）大鼠术后一般情况及体重变化，术后每天称量各组大鼠体重，与正常大鼠对比。
（2）生存时间：计手术关腹为零时，取时间点术后1、2、3……19、20、22、24、28、32、40、48、60h，及术后3～7d观察。
（3）肝再生情况：
① 对72h内死亡的大鼠及处死的长期存活大鼠立即进行解剖并称出肝尾状叶重量，用以下公式[6]计算肝再生率：
Liver Regeneration Rate(%)＝100х[C-(A-B)]，
其中A为估算的手术时肝重：预先取5只相当重量的SD雄性大鼠，测得正常大鼠肝脏占体重为4.2%±0.1%，以此乘以各组大鼠手术前体重。B为切除的肝叶重量即术前、术后体重差值。C为剩余的肝尾状叶重量。
② 取不同时间点大鼠的肝脏，在组织病理学上分别进行HE染色和PCNA染色，观察肝细胞破坏和再生情况。于高倍显微镜下观察5个视野，每个视野中随机选取100个肝细胞，计数其中PCNA(+)细胞的个数并取平均值，间接反映肝脏再生能力。
6．统计学方法
本组数据以 X ± S表达，经Student-t检验。

结果
（1）大鼠在90%肝切除后均能从麻醉中苏醒并至少存活5h。在对照组中死亡率为100%，平均存活时间为（10.7±1.9）h。在死亡的大鼠尸体解剖时均未发现有术后的大出血或血管栓塞等并发症，证明大鼠的死亡是由于术后的肝功能衰竭而引起。
（2）所有大鼠从麻醉中苏醒后，一般情况差，低头俯卧位，偶更换位置，并对外界刺激反应弱。约1～2h后开始饮少量水，极少进食。其中Ator组和AG490组大鼠较Ctrl组大鼠略为活跃。术后6h起开始出现大鼠死亡，在术后8～12h和18～24h分别达到高峰。术后24h Ctrl组大鼠已全部死亡， 两实验组仍有部分存活，这些存活的大鼠已开始主动大量饮水、咀嚼鼠食。术后48h，93.8% Ator组和75% AG490组大鼠死亡。存活的AG490组大鼠在此后都能长期存活。
（3）大鼠肝切除后剩余肝脏呈弥漫性黄色变性，病理组织切片HE染色可见剩余肝细胞变性、坏死（图1 A）；PCNA染色可见术后48h内肝细胞DNA合成明显、增生水平较高（图1 B）。PCNA计数和肝再生率的变化趋势略有不同，但都反映出术后72h肝脏的再生已经达到一个高峰（图2）。术后120h肝脏再生明显（图2）。而且对存活超过7d的大鼠进行解剖，发现肝脏的增生已经超过了术前的1/2左右。
（4）与正常组大鼠体重每天均匀递增相比，Ator组大鼠体重缓慢下降；AG490组大鼠的体重变化明显，在术后第三天达最低点，后逐渐回升（图3）。
（5）阿托伐他汀的应用明显地延长了大鼠的存活时间（25.6 ± 4.5）h vs. （10.7 ± 1.9）h, p<0.05，图4）。AG490的腹腔内注射起到了更为明显的效果（30.6 ± 6.3）h vs.（10.7 ± 1.9）h, p<0.05，图4）。

讨论
临床上，对于那些有巨大肝脏占位病变的患者，扩大肝切除是唯一有希望治愈的手段，但此时患者常合并肝硬化等疾病，手术风险极高，如在术后引起爆发性肝功能衰竭，死亡率可达70%～90%。如何保护此类手术后肝脏的功能，使其度过前48h的风险期是肝脏外科的一个难题。现有的各种措施，包括人工肝和其他支持方法效果均有限。我们的实验发现，肝切除术后增生反应即时启动，但这种增生在48h内不足以代偿肝细胞功能，大鼠因此而死亡；到72h肝脏增生达到一个高峰，此后大鼠多能存活。因此，寻找合适而有效的措施帮助剩余的肝脏度过这段风险期尤为重要。本研究通过多次预实验，最后设计并采用了特异性炎症介质和P21- RAS信号阻滞剂，在国际、国内首先证明，通过上述的阻断显著延长了90%肝切除后大鼠的生存时间。
我们采用了标准的大鼠90%肝切除模型，它是一种Emond方法[5]的改良术式。我们的实验表明，90%肝切除后的大鼠在24h内死亡率为100%。采用这个极限肝叶切除模型的目的是要造成极度的肝功能损害，以此来检验相应的治疗措施。
阿托伐他汀抑制了P21-RAS的信号传导，阻断了后者对肝细胞功能的特异性损害，结果延长的手术后大鼠的生存时间。由于此药目前在临床上已经被使用，主要用于对高血脂患者的降血脂作用，它的临床使用安全性已被证实，因此本实验的结果为以后在重大肝手术患者术后直接辅助使用阿托伐他汀来保护肝细胞的功能提供了一定的依据。
我们在此研究前考虑过炎症介质的过度表达对全身脏器包括肝脏的损害，但现有的抑制各种炎症反应的药物较多，然而具特异性抑制的并不多见。在预实验中作者曾应用了诸如非甾体类抗炎药等抑制剂，但初步效果均不明显。细胞因子受体超家族信号传递的必经途径是Jak-Stat信号通路，阻断此通路能特异性地抑制炎症效应，AG490 [a-氰-（3，4-二羟基）-N-苄基肉桂酰胺] 是Jak-2蛋白激酶的特异阻滞剂[4]，目前尚未应用于临床。我们最后选择了这种特异性的阻断剂，实验结果显示了意料之外的良好效果，术后大鼠存活率有所提高，其效果甚至优于阿托伐他汀。可见，扩大肝切除术后过度的炎症反应对剩余肝细胞的破坏作用比我们想象的更为严重。
极限肝切除术后通过阻断炎症介质和P21- Ras来保护肝细胞功能的概念，为这种措施在临床上的应用奠下了一定的理论基础。

参考文献

1 Michalopoulos GK, Defrances MC. Liver Regeneration. Science, 1997, 276: 60-66.
2 Cai SR, Motoyama K, Katherine J, et al. Lovastatin decreases mortality and improves liver functions in fulminant hepatic failure from 90% partial hepat-ectomy in rats. J hepatol, 2000, 32: 67-77.
3 Kountouras J, Boura P, Lygidakis NJ. Liver regeneration after hepatectomy. Hepato-Gastroenterol, 2001, 48: 556-562.
4 Levitzki A. Tyrphostins--potential antiproliferative agents and novel molecular tools. Biochem Pharmacol, 1990, 40: 913-918.
5 Emond J, Capron-Laudereau M, Meriggi F, et al. Extent of hepatectomy in the rat. Eur Surg Res, 1989, 21: 251-259.
6 Okano T, Ohwada S, Nakasone Y, et al. Blood transfusion causes deterioration in liver regeneration after partial hepatectomy in rats. J Surg Res, 2001, 101: 157-165.