毛一雷#，于卓，卢欣，桑新亭，杨之英，钟守先

中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院 肝脏外科中心
北京，100730

*本研究受到美国Li-Foundation Heritage Prize 基金资助

摘要
目的：我们此前的研究首先证明了应用炎症介质阻断剂能延长极限肝切除术后大鼠的存活时间，但其机理尚不清晰。本研究在于探明应用特异性炎症介质阻断剂AG490后，增加的术后生存率和肝功能变化之间的关系及其机理。方法：90%肝切除大鼠随机分为对照组和AG490组，后者术中至术后36h内每12h腹腔内注射AG490（1mg·kg-1），观察术后生存率、检测各项肝功能及血糖指标。结果：对照组与AG490组的术后存活率比为0％ vs. 25%；实验组大鼠的术后转氨酶和血糖明显优于对照组，并在48h后胆红素有明显下降；两组大鼠的血清蛋白水平均有缓慢下降但无差异。结论：本研究首先报道了AG490显著提高极限肝切除术后大鼠的生存率，这种作用主要受益于其对剩余肝功能的保护，而非促进肝脏再生。此结果为阻断炎症介质在肝外科的应用奠下了一定的理论基础。

关键词：90%肝切除；极限肝切除；生存率；肝功能；AG490

The mechanisms of Increased Survival Rate by Administration of
AG490 and in Rats Following Extensive Liver Resection

Yilei MAO, Zhuo YU, Xin LU, et al

Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Peking Union Medical College Hospital, Liver Surgery Center, Beijing 100730

Abstract
Objective: We have recently proven that the pro-inflammatory cytokine signaling inhibitor AG490 increases the survival time following extensive liver resection(90% partial hepatectomy) in rat. But the mechanism remains unknown. Further researches on the relationship between the increased survival rate and the changed liver functions in rat following hepatectomy is necessary. Methods: Rats were divided randomly into two groups after surgery: Ctrl Group, without treatment; AG490 Group, with AG490 (1mg•kg-1•12h-1) administration intraperitoneally, immediately and through 36 hours after the operation. The survival rate and the serum liver functions of the rats were observed. Results: The ratio of survival rate of Ctrl Group and AG490 Group is 0% vs. 25%. AG490 Group has significantly better blood glucose and aminotransferase levels; and serum bilirubin levels decrese rapidly by 48 hours after the operation. Serum protein levels in both groups decrease slowly, without significance between groups. Conclusions: It is the first report domestically and internationally to describe that the cytokine signaling inhibitor AG490 significantly increase the survival rate of rats following extensive liver resection. It mainly benefits from the protection towards residual liver, rather than the promotion of liver regeneration. This result implies the theoretical basis of clinical application of pro-inflammatory cytokine signaling inhibitor in liver surgery in the future.

Key Words: 90% Hepatectomy; Extensive liver resection; liver function; Survival rate; AG490

引言 
极限肝切除术后如引起爆发性肝衰竭，死亡率极高，这可能同术后前48小时内过度的炎症应激反应有关[1,2]。然而，此课题在国际、国内肝外科领域里讨论不多，知之甚少。我们在此前的研究中曾用90％肝切除的大鼠模型[3]，首先证明了应用P－21RAS阻断剂或炎症介质特异性阻断剂AG490延长了术后大鼠的存活时间，其中尤以抗炎的AG490效果为明显[4]，其结果在该领域里提出了新的概念。但其延长存活时间的机理尚不清楚，本实验的目的在于进一步探明应用AG490[5,6]后，增加的术后生存率和肝功能变化之间的关系及其机理。

材料与方法
1．实验动物
Sprague-Dawley雄性大鼠，体重220g～270g，由中国医学科学院实验动物中心提供。动物在控制温度、湿度及12小时照明与12小时黑暗交替的环境中饲养，允许随时自由食用固定标准饲料和清水。
2．药品与器材
手术器械由北京协和医院外科和动物中心提供。
AG490购自Calbiochem公司(San Diego, CA, USA)，每5mg用5ml DMSO-15ml ddH2O充分溶解，每次注射1mg/kg B.W.。
3．实验分组
肝切除手术的大鼠（n＝38）随机分为2组。Ctrl组（n=10）：术后即时及术后12、24、36小时各腹腔内注射生理盐水1ml。 AG490组（n=28）：术后即时及术后12、24、36小时各腹腔内注射AG490溶液1ml (1mg·kg-1·12h-1)。

4．手术处理
大鼠90％肝切除：根据Emond等[3]的方法进行改良。上腹部正中切口，用丝线分别结扎外侧叶、中叶、右下叶及右上叶，并予切除。观察剩下的尾状叶无淤血后关腹。
5．检测内容
（1）生存率：计手术关腹为零时，取时间点术后1、2、3……19、20、22、24、28、32、40、48、60小时，及术后3~7天观察。
（2）血清生化指标：术后8、12、24、48、72、96、120小时从大鼠眶后静脉丛取血1ml，大鼠死前从心室取血3ml～4ml；血样经3000 x g 离心5min后取血清，送北京协和医院检验科生化实验室，用大型全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶（Alt）、天冬氨酸氨基转移酶（Ast）、血糖（Glu）、总胆红素（TBil）、直接胆红素（DBil）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）水平等。

6．统计学方法
应用SPSS 11.0.0标准版(SPSS Inc.，USA) 统计软件进行统计。数据以c ± S x来表达，经过Student-t检验后，以p<0.05为有显著意义的差异。

结果
（1）对照组大鼠在24小时内全部死亡，AG490的应用使２５％的大鼠得以度过术后48小时的危险期并长期存活（图1）。这些存活的大鼠逐渐恢复正常状态，体重开始增加，于术后10d～14d时达到手术前水平，能正常饮食、活动。
（2）分析同一指标用眶后静脉丛取血和心室取血两种不同方法取得的数据，未发现显著差异，表明采用两种不同的取血方法对结果没有影响。
（3）Alt、Ast：术后8h和12h，AG490组大鼠的肝细胞酶显著低于对照组，此后逐渐下降。其中长期存活的大鼠在术后8h和12h之间曾有一高峰，但此后迅速下降，至术后48h～72h已降至可以接受的水平（图2a～2d）。
（4）血糖：AG490组血糖水平明显高于对照组、几乎是后者的两倍，也即更接近正常范围。长期存活的AG490组大鼠在术后24h高于其他大鼠，此后血糖平稳上升，趋向正常水平（图3a、3b）。
（5）胆红素； 术后前12h实验组大鼠的总胆红素和直接胆红素均高于对照组，并一直维持在一个较高的水平，至术后48h迅速下降（图4）。
（6）蛋白：术后对照组与实验组大鼠的总蛋白和白蛋白均无明显差异。对照组大鼠的总蛋白水平于术后48h达到最低点后缓慢回升；白蛋白的变化较总蛋白滞后。AG490组中长期生存的大鼠和其他大鼠也有类似变化趋势（图5a～5d）。

讨论
极限肝切除后高死亡率是肝外科的难题之一，人们曾用多种方法试图消除对剩余肝的损害、保护其功能[7,8]，但对炎症介质的过度反应可能造成的肝细胞损害却一直未予重视，新近的看法越来越注意到这种损害所起到的重要作用[2,9]。我们此前曾用稳定的大鼠90％肝切除的模型，在国际、国内首先应用P－21RAS阻断剂阿托伐他汀和特异性炎症阻断剂AG490来延长大鼠术后的生存时间[4] 。虽然实验提示肝脏再生在肝切除后能即刻启动，但影响存活的有效再生却要在术后48h～72h才开始显示。我们的研究提示了这种术后生存时间的延长，并非由促进肝脏再生所致，而可能同保护了剩余肝脏的功能有关。
根据此前研究的结果，本实验的主要目标集中在特异性炎症阻断剂AG490上。进一步观察90％肝切除术后大鼠发现，应用AG490后生存率提高到25％，也就是有近四分之一的大鼠用药后竟然在术后能长期生存；而对照组大鼠在术后24小时内全部死亡。如上所述，这种提高了的生存率不可能同肝脏的即刻再生有关。我们进一步检查了大鼠的肝功能情况，发现实验组的Alt和Ast水平在术后前12小时内均显著低于对照组。当我们将AG490组中长期存活的大鼠和其他大鼠相比时发现，前者的Alt和Ast水平在术后8h～12h曾有一高峰，但此后奇迹般的迅速下降，至术后48小时和72小时已降至可以接受的水平。因肝脏转氨酶的变化常常反应了肝细胞的损害程度，该结果表明术后短期内抑制炎症反应能明显减少肝细胞的损害，同时说明肝脏酶学的变化对估计肝切除手术的预后是敏感的，并具重要意义。
我们进一步观察了实验组和对照组血糖的变化，发现有较高生存率的AG490组血糖水平明显高于对照组，也即更接近正常范围。在对比长期存活和其他AG490组的大鼠中，也发现了类似的情况。以往在评价肝功能和估计预后时往往并不将血糖水平列入主要指标，本实验的结果显示了术后早期血糖的改变其实是肝脏手术预后的一个重要指标，暗示了潜在的临床意义。
在观察肝脏胆红素代谢情况时，令人意外的是术后前12小时AG490组大鼠的总胆红素和直接胆红素水平都高于对照组，但其结果却并不影响实验组动物生存率的增加和生存时间的延长。胆红素的下降在实验组发生在48小时以后，这说明了抗炎症介质对胆红素的影响是滞后的，而且可能与再生相关；但只有当最后改善了胆红素的代谢，生存率才得以提高。
在本实验中我们同时观察了血清蛋白水平的变化，发现无论是总蛋白和白蛋白，在对照组和实验组中均无明显差异；在长期生存的和非长期生存的AG490组大鼠中也无明显差异，而且手术后前三天血清蛋白的变化总体上呈缓慢下降趋势，这恰恰符合了新近的概念，也即血清中白蛋白的变化是全身性炎症反应综合征（SIRS）的一个表现，在创伤因子有效去除以前，低水平的蛋白将不会有明显的改善[10 mao 实外，2000/1, 4期]。
我们的研究不但首先提出了阻断过度炎症反应在广泛肝切除术后的重要性，而且首先分析了其肝功能的变化细节并阐述了部分机理。结果表明对抗炎症反应所增加的术后存活率同其有效的保护了肝功能密切相关；在术后初期观察肝脏酶谱和血糖的变化尤为重要，可能同预后密切相关；术后三天内胆红素的变化趋势也是预后的指标之一；而血清中的总蛋白和白蛋白水平对抗炎干预并不敏感，受到各种创伤因素影响较大。进一步的研究可以牵涉到了解各种促炎介质的表达和肝细胞内炎症信号传递的情况。其整体的研究结果将有助于将合适的抗炎药物应用于肝外科临床。

参考文献
1 Tom L, Christian L, Michael P.M., et al. Losing balance: cytokine signaling and cell death in the context of hepatocyte injury and hepatic failure. Eur Cytokine Netw, 2002, 13: 377-383
2 于卓，毛一雷. 肝切除术后过度炎症反应的临床现状和进展. 中国实用外科杂志，2004，24: 124-125
3 Emond J, Capron-Laudereau M, Meriggi F, et al. Extent of hepatectomy in the rat. Eur Surg Res, 1989, 21: 251-259
4 毛一雷，于卓，桑新亭 等. 极限肝切除术后延长大鼠生存时间的研究. 中华普通外科杂志，2004，19 印刷中
5 Levitzki A. Tyrphostins－potential antiproliferative agents and novel molecular tools. Biochem Pharmacol, 1990, 40: 913-918
6 Naftaly M, Tom G, Harjit D, et al. Inhibition of acute lymphoblastic leukemia by a Jak-2 inhibitor. Nature, 1996, 379: 645-648
7 Cai SR, Motoyama K, Katherine J, et al. Lovastatin decreases mortality and improves liver functions in fulminant hepatic failure from 90% partial hepat-ectomy in rats. J hepatol, 2000, 32: 67-77
8 James, G. The biology of signal transduction inhibition: Basic science to novel therapies. Semin Oncol, 2001, 28(5 suppl 17): 3-8
9 Yo-ichi Y, Mitsuo S, Takayuki H, et al. Effects of preoperative steroid administration on surgical stress in hepatic resection. Arch Surg, 2001, 136: 328-333
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11 Kazuya K, Minoru M, Mitsuo K, et al. The immunostimulant OK-432 enhances liver regeneration after 90% hepatectomy in rats. Hepatol, 1994, 19: 1241-1244
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