毛一雷1 于卓2 

中国医学科学院 中国协和医科大学
1北京协和医院肝外科中心, 北京100730，2肿瘤医院外科

摘要

炎症反应是生物体在进化过程中选择的一套复杂的防御体系，能激发适当的应答。然而手术和创伤可能诱发过度炎症级联反应，导致严重损伤甚至死亡。肝脏手术后的过度炎症反应可能更为显著和关键。初期的抗炎症介质治疗研究主要集中在各种促炎因子的抗体、受体、拮抗剂和竞争性受体拮抗剂上，新近研制的Drotrecogin Alfa（活化）是重组的人活化C蛋白，它是美国FDA批准的第一个有关的治疗严重败血症药物。最近笔者曾在动物模型上应用细胞因子信号转导阻滞剂AG-490和P21-Ras信号阻断剂Atorvastatin；在临床上对肝手术患者应用乌司它汀进行治疗，均取得了一定的良好效果。
关键词：肝脏手术，炎症反应，抗介质治疗

Overwhelming Inflammatory Response and Liver Resection, Liver Injury

MAO Yilei1, YU Zhuo2. 1Liver Surgery Center, Peking Union Medical College Hospital, PUMC, and Chinese Academy of Medical Sciences, 2Department of Surgery, The Cancer Hospital, Beijing 100730

Abstract

Inflammatory response forms a series of complicated defense system that has been chosen by human being during the long-term evolution. This system evokes suitable reaction to achieve the new balance. Surgery and trauma may induce overwhelming inflammatory cascade, which could cause severe complications and even death. This kind of inflammation following liver surgery may present clearer and more importantly. The earlier anti-inflammatory medium treatments had been concentrated on the antibodies, inhibitors, and receptor antagonists of pro-inflammatory factors. The later developed Drotrecogin Alfa (active) is a recombinant human active Protein C, which is the first of this kind to be approved by FDA in the US. Recently, we have employed intracellular signaling inhibitor AG-490 and P21-Ras blocker Atorvastatin in an animal model, and ulinastatin in the patient following liver surgery. The primary results suggested a promising outcome. 
Key Words: Liver surgery, inflammatory response, anti-medium therapy

炎症应急反应是一个极为复杂的生理和病理生理过程，人类经过长期的进化已使这种炎症反应变得如此精细、敏感和繁杂，它有众多的调节机制参与其中，并形成一种互相作用的网络。虽然现代分子生物学、细胞生物学技术的出现已对炎症介质内在联系的认识有了突飞猛进的进展，迄今，我们所了解的我们认为的全部知识可能仅仅是其中的一小部分。一般认为，机体的创伤所引起的最初的炎症反应是一种重要的防御性机制，可认为是生理反应的一部分；但严重的创伤常能引起炎症介质的过度释放，后者能造成局部和全身的损害。问题是有些创伤，如重大外科手术是无法避免的。
对于肝脏占位性病变，肝脏的部分切除仍是主要可能治愈的方法之一，但手术本身能对剩余的肝脏以至全身带来严重的创伤，有些术前肝功能欠佳的患者可能因为不合适的肝切除，引发术后爆发性肝衰竭，造成患者死亡。近年来，对扩大肝切除术后肝功能损伤的机理和相应对策的研究有了一定进展，已成为一个热门话题。但对其中炎症介质过度反应在肝切除术后的作用尚知之甚少，而在此方面的进展尤其引人注目。本文结合作者的一系列研究结果对这一问题进行初步的探讨。

1 炎症介质在手术/创伤中的作用
外科手术和创伤打击直接导致体内三种体系稳态平衡的变化：内分泌系统的下丘脑-垂体-肾上腺轴、交感神经系统的应激和急性期应答反应[1，2]。如果大量组织损伤所致的超强打击超过了局部调节能力，则过度的急性期应答反应（Acute Phase Response,APR）及其产生的过量细胞因子将破坏自身本已不堪重负的防御系统，即临床上发生各种手术/创伤后并发症。
细胞因子通过与特定的受体结合，激活细胞内信号通路并启动相应的基因转录，调节各种细胞的分化、生长、分裂和死亡。一种细胞因子可以调节其他细胞因子的产量和活性，从而完成反应信号的扩增，在炎症反应中表现为炎症的扩大（促炎性细胞因子）直至多器官衰竭，或者炎症的消退（抗炎性细胞因子）直到稳态平衡的重新建立。
在炎症反应中，细胞因子的多向性（同一细胞因子对不同靶细胞有不同作用）和重叠性（不同细胞因子对同一靶细胞有相同作用）使得除了一些主要细胞因子的作用得到了公认之外，相当一部分细胞因子的作用仍存在争议。
TNF-α是急性损伤和感染后，最早出现和最强效的宿主反应介质[2]。TNF-α主要来源于巨嗜细胞和单核细胞，作为一种化疗药能引起大鼠肿瘤内出血坏死；同时有肝脏毒性，参与缺血/再灌注、酒精性肝炎和病毒性肝炎造成的肝脏损伤。IL-1是经典的炎症反应致热源，由活化的巨嗜细胞和内皮细胞表达，可分为IL-1α和IL-1β两种。IL-4由活化的Th2细胞分泌，在体液免疫和抗原呈递方面尤其重要,并可辅助B淋巴细胞完成类转换。IL-6是肝脏急性期应答反应的重要介质，它一般由组织在TNF-α或IL-1刺激下分泌，促进可溶性TNF受体和IL-1受体拮抗剂释放。IL-10能降低实验性内毒素血症和感染性腹膜炎动物体内的TNF-α水平、减轻其有害作用、降低死亡率。IL-18是巨嗜细胞分泌的促炎性细胞因子，作为TNF-α和Fas-L的下游产物，参与炎症反应对肝细胞的损害。
炎症反应是生物体在漫长的进化过程中选择的一套复杂而精巧的生理防御体系，其中互相协同作用又相互制衡的细胞因子能准确激发机体适当的应答反应，使机体尽快回复稳态平衡。然而相当强度的刺激可能诱发过度炎症反应，如未及时控制势必引发细胞因子的级联反应，把正常组织与致病原一并清除，引起更大规模的损伤。临床医生如不尽早给予阻断过度炎症反应的治疗而任其发展，那么到了后期将可能出现各种并发症，甚至导致患者死亡。

2 肝脏切除手术后的创伤和炎症反应
肝切除手术引起细胞破坏分为调亡和坏死[3]。调亡是指组织器官在发育、更新过程中，特定细胞在由半胱氨酸--天冬氨酸蛋白酶（Caspase）级联反应激活的信号指导下，进行复杂而有序的自身清除。而坏死是细胞在过度刺激下，被动发生的急性代谢失调、离子紊乱、ATP不足等导致细胞肿胀、溶酶体激活，细胞膜破裂、胞内物质外流、细胞裂解。
临床上，肝脏切除手术常常引起肝脏的代谢功能、生物转化作用和分泌与排泄功能紊乱或丧失。这种损害通常表现为术后患者血浆特定蛋白水平的升高或下降、肝酶和胆红素上升、凝血时间延长等。这些变化已在临床上被证实[4,5]，
它们可能是肝脏APR的直接结果。
APR由全身炎症或局部损伤引发，是机体抵抗致病因素、促进组织修复、维护自身内环境平衡与稳定的防御反应，一般表现为发热、中性粒细胞增多、脂质代谢紊乱、负氮平衡、急性期反应蛋白（Acute Phase Protein, APP）的变化等等[6]。APP几乎全部由肝脏合成、以糖基化形式分泌，其中Ⅰ型APP由IL-1样细胞因子（IL-1α、IL-1β、TNF-α、TNF-β）介导产生。而Ⅱ型APP由IL-6样细胞因子（IL-6、LIF、IL-11、OSM、CNTF和CT-1）介导产生。APP能造成周围组织和全身器官不同程度的损伤，一般情况下这种破坏在机体自身调节的范围之内，是可逆的。但如果患者体内的APR无法控制，过度的APP将引发炎症介质的级联反应，最终发生严重的并发症，甚至患者死亡。
活化的巨嗜细胞在炎症反应中起重要作用。定植于肝脏的巨嗜细胞即枯否细胞（Kupffer cells），在人体巨嗜细胞库中占据最大的份额。肝脏损伤能引起大量细胞因子的释放，引发局部和全身的炎症反应[7]。部分肝切除后产生的急性期反应蛋白，无论从血浆水平还是mRNA水平上都与全身性急性应答反应中所观察到的情况一致，至于肝脏手术是否较其他部位的手术使机体遭受更大的损害，在观察了半肝切除病人体内的炎症因子后，一般认为肝切除术与食道、胃、胰腺、直肠等部位手术给病人造成的打击程度，没有显著差异[8],而目前在针对肝切除术后对抗过度炎症方面的努力却研究甚少。
肝切除/损伤后，一方面高表达的TNF-α和Fas-L激活Caspase级联反应，最终由Caspase-6、7、3共同执行细胞调亡的命令；另一方面，肝切除5分钟后活性氧（reactive oxygen species, ROS）即被TNF-α激活[9]；ROS 活化IκB激酶β（IKK-β），后者磷酸化并降解NF-κB的抑制物IκB ，解除了接触抑制的NF-κB 从胞浆转移到细胞核内、结合到特定的启动子上，并开始相关基因（Bcl-2 家族）的转录[3，10]。尽管TNF-R1有类似Fas C-末端胞内区的“死亡域”（Death domain）传递“死亡信号”激活Caspase级联反应的作用，但它同时还能活化转录因子NF-κB。关于NF-κB在Fas-L介导的细胞调亡扮演何种角色，仍存争议。肝切除术后JNK激酶被活化；JNK的表达部分依赖于TNF-α。JNK不仅自身参与EGF的再生作用，而且磷酸化肝脏再生中的重要因子c-fos。
肝切除术造成肝组织量锐减，即刻反应产生大量TNF-α和起主要拮抗作用的IL-6，另有与肝脏再生相关的HGF、TGF-α、EGF等生长因子[10]。IL-6与细胞膜IL-6受体（1个gp80和2个gp130）结合后，胞内gp130的不同磷酸化位点可以分别激活Stat1、Stat3或Ras/MARK通路。磷酸化的Stat3二聚体在辅助转录因子C/EBPβ和AP1的协同作用下启动c-fos、c-myc、NF-IL-6等基因的表达。这一信号传导通路的自然负调节因子是SOCS3，以保证增生的适度中止。
同其它类型的创伤一样，肝脏手术后炎症介质的过度反应能引起肝脏以至全身的明显损伤。它可能要比其它创伤引起的损伤更为显著，也更为关键，因为对于肝脏手术后的患者，进一步的肝功能的损害极可能导致严重的并发症，引起爆发性肝衰竭，甚至导致患者死亡。
促炎与抗炎物质间的平衡，很大程度上决定了肝切除患者的预后。以往认为血浆中TNF-α与IL-10浓度的比率可以反映这种平衡，而Jerin等人[7]发现采用血浆中IL-6与IL-10浓度的比率更加合适。

抗炎症介质治疗的现状

从理论上推测，抗细胞因子治疗通过阻断炎症介质作用的各个环节，清除过多的促炎症介质，阻断或干扰机体过度的炎症、凝血反应可能使人体内的促炎机制和抗炎过程、促凝和纤溶过程趋于平衡，从而减弱机体的损害，有效地改善病人的预后。
过去十年中，医学工作者做了大量的基础和临床研究。最初的抗介质治疗研究主要集中在各种促炎因子的抗体、受体、拮抗剂、竞争性受体拮抗剂上，如TNF的单克隆抗体、可溶性的TNF受体， IL－1受体拮抗剂 (IL-1Ra)，IL－6单克隆抗体等[11，12]，虽然相关的动物试验及临床前期研究提示了潜在的临床应用价值，但在随后的临床试验中并没有得到预期中的成功，不能有效地降低患者死亡率。尽管有少数观点认为在严格选择病例的前提下，这些针对单一介质的治疗或多或少是有益的，但多数观点认为在这方面的临床试验结果是令人失望的[13]。
最新的一些研究获得了一些令人鼓舞的结果。活化的C蛋白（activated protein C）是目前为止所发现的第一个也是唯一一个在临床抗介质治疗中被证实有效的物质[14]。C蛋白最早由Seegers发现并加以分离，是一种维生素K依赖性糖蛋白。这种蛋白一旦被凝血酶-抗凝血酶激活，就能通过抑制凝血因子Va和VIIIa起到抗血栓形成的作用；活化的C蛋白还能抑制单核细胞活性，减少IL-6、IL-1、TNF-α等促炎因子的产生；它还能阻止白细胞粘附到血管内皮细胞上，从而使得白细胞从血管内外渗。在临床上，如严重败血症患者的C蛋白浓度急速下降，则死亡危险增加。
目前开始应用于临床的Drotrecogin alfa（活化）是美国FDA批准的第一个治疗严重败血症药物（商品名为Xigris，Eli Lilly and Company，Indianapolis，IN），属于一类新的抗凝血酶凝血抑制剂，是重组的人活化C蛋白[15,16]。2期临床研究显示，对于严重败血症患者，它能降低血浆中凝血标记物（D-dimers）和炎症标记物（IL-6）的水平，其作用呈剂量依赖型。最近的临床3期PROWESS试验（Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis trial）是一项随机双盲、安慰剂对照的多中心研究，有11个国家的164个中心参与，证实Drotrecogin alfa对于降低严重败血症患者的死亡率有效。但是，Drotrecogin alfa作为一种天然的抗凝药物，出血是其难以回避的不良反应，PROWESS试验的结果显示，Drotrecogin alfa治疗组比安慰剂对照组的出血危险增加（P=0.06），因此有人建议治疗过程中应维持血小板计数在30,000/dl以上。它的其它不良反应还包括心律失常、心肌梗塞等，但和安慰剂对照组相比没有明显差异，因此目前认为其不良反应仍主要表现为出血。
遗憾的是，外科医生和基础研究工作者似乎均没有把更多的注意力集中在过度炎症反应的损害和广泛肝切除的关系上，上述的各种抗炎症介质的措施和药物均不是为肝外科手术而设置，也似乎没有在肝切除手术中得以尝试或验证。过度的炎症反应对肝切除术后剩余肝的损害究竟有多大，其重要性又是如何，我们知之甚少。最近，笔者进行了一系列有关的动物研究，选择了细胞因子信号转导中JAK2激酶磷酸化的抑制剂AG-490和P21-Ras信号阻断剂Atorvastatin，用于大鼠90%肝切除模型中取得了良好的结果，详见后述。

4 肝切除术后抗细胞因子的应用对策
扩大肝切除后易引发暴发性肝衰竭（Fulminant Hepatic Failure，FHF）。发生FHF的患者死亡率高达70-90％。近年来各种术后护肝方法，包括药物治疗和肝脏辅助设备等莫衷一是，效果均不能肯定。但是大部分上述的方法忽视了本文在前面提到的肝切除术后过度炎症反应的因素，很少有作者研究阻断炎症介质对扩大肝切除术后的影响。在查询的诸多文献中，仅Yamashita[17]和Wustefeld[18]有相关的报道。Yamashita发现，应用最直接的炎症/免疫抑制剂糖皮质激素，能促进IL-10升高，IL-6、CRP和胆红素水平降低。Wustefeld则观察到肝细胞生长周期的抑制蛋白p21被IL-6的下游信号蛋白Stat3上调，IL-6的过度刺激抑制肝脏再生，是不利因素。
笔者基于上述有关保护剩余肝细胞、阻断过度炎症反应的理论，设计了相应的研究。具体方法是：大鼠90％肝切除后随机分为对照组、Atorvastatin组和AG490组三组，观察术后不同药物组的一般情况、生存时间和生存率、肝功能和相应的细胞生物学实验指标。结果发现，大鼠90%肝切除术后给予p21-RAS阻断剂阿托伐他汀（Atorvastatin），显著延长大鼠存活时间[19]。另一组大鼠术后给予特异性炎症介质阻断剂AG490，不但显著提高术后动物的存活时间，而且有存活率的显著上升，从致死模型中存活率的0%升高到治疗后的25%。病理学检查发现术后剩余肝脏损害严重，肝脏再生即刻启动，但是其有效的代偿主要在术后48h的风险期以后占主导地位。而术后48h之内的存活，与AG490的使用有着密切的关系。比较AG490组和对照组的各项肝功能发现，包括血糖、肝细胞酶、胆红素在内的多种生化学指标有相应的明显改善 [20]。细胞生物学实验表明，AG490通过抑制Jak2激酶的磷酸化，阻断Jak2-Stat3细胞因子信号转导通路、抑制过度的炎症反应，具体表现为IL-6水平下调和IL-10水平上调以及两者的比值变化。通过此系列实验，笔者认为AG490提高极限肝切除术后大鼠的生存率、改善生存情况，主要在于阻断过度炎症反应、保护剩余肝细胞损害，而非促进残余肝再生。
然而，从AG490的实验结果到最终走向临床还有一段漫长的道路，其临床效果尚不得而知。但我们的研究证实了过度炎症反应在肝切除术后起到重要作用的假设，并可以进行有效的阻断，这方面的研究将是一个方兴未艾的课题。动物实验中应用的p21-Ras阻断剂Atorvastatin目前已开始在我们的肝脏手术患者中应用。同时正在进行的是一个在临床肝切除患者中应用广谱酶/炎症抑制剂的临床研究，不久将会有初步的结果。总之，目前在基础实验和临床研究中，对于这种肝术后的抗炎应对措施及其机理还了解不多，但其重要性已渐渐显露，尚需大量研究来揭示它们的作用。

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