毛一雷*，于卓，桑新亭*，卢欣*，杨志英*，钟守先*

中国医学科学院、中国协和医科大学
*北京协和医院 肝脏外科中心，肿瘤医院 外科，北京100730

获第七届全国普通外科中青年医师学术交流会优秀论文一等奖

摘要

目的：我们此前的研究首先证明了AG490能提高极限肝切除术后大鼠的生存率并改善肝功能，本研究在于探明它对细胞因子信号转导及肝内细胞因子表达的影响。方法：90%肝切除大鼠随机分为对照组和AG490组，后者术中至术后36h内每12h腹腔内注射AG490（1mg·kg-1），其间检测磷酸化Jak2和Stat3蛋白水平，并测定剩余肝中IL-6和IL-10 的表达。结果：应用AG490后，术后8h和12h细胞因子信号蛋白Jak2和Stat3磷酸化显著下降并递次改变，大鼠肝脏中IL-6表达、IL-6/IL-10比值下降，而IL-10的表达增高。结论：阻断细胞因子信号通路能提高极限肝切除术后大鼠生存率，它为最终临床应用奠下了一定的理论基础。

关键词：极限肝切除 Jak-Stat AG490 IL-6 IL-10

Inhibition of Jak-Stat signal pathway: a mechanism of increased survival rate following extensive hepatectomy in rats

MAO Yilei*, YU Zhuo, SANG Xinting*, et al
Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,
* Liver Surgery Center, PUMC Hospital, Beijing, 100730, and Cancer Hospital

Abstract

Objective: we have recently proved that cytokine signaling inhibitor AG490 significantly increases the survival rate following extensive liver resection (90% partial hepatectomy) in rat. But the molecular mechanism remains unknown. The aim of this study was to investigate the impact of AG490 on cytokine signaling pathway with phosphorylation levels of Jak2 and Stat3, and liver pro-/anti-inflammatory cytokine expressions. Methods: rats were divided randomly into two groups after surgery: Ctrl Group, without treatment; AG490 Group, with AG490 (1mg•kg-1•12h-1) administration intraperitoneally, immediately and through 36 hours after the operation. Western Blotting was used to detect the levels of phosphorylated Jak2 and Stat3. Semi-quantitative RT-PCR was employed to examine IL-6 and IL-10 expression. Results: at 8h and 12h post-operation, the phosphorylation levels of Jak2 and Stat3 were significantly inhibited in the AG490 group when compared with the Ctrl group. The DNA levels of IL-6 in the liver of the AG490 group rat at the same time points were also decreased, whereas IL-10 levels markedly increased, that made the ratio of IL-6/IL-10 dropped significantly. Conclusions: AG490 increases the survival rate of the rats following extensive hepatectomy via a mechanism of blocking cytokine signaling transduction and consequently suppressing the ratio of pro-/anti-inflammatory cytokine expression, which exerts potential clinical implications of use of anti-inflammatory agents in hepatic surgery. 

Key Words: Extensive hepatectomy Jak-Stat AG490 IL-6 IL-10 

极限肝切除手术后患者的死亡率较高，如引起爆发性肝衰竭死亡率可达70 ~ 90 %，是肝外科的一个难题。以往少有作者将这种术后肝脏损害同过度的炎症应急反应相关联（1）。我们在此前的研究中曾证实了炎症介质特异性阻断剂AG490能延长大鼠的生存时间，提高存活率，并探明AG490的作用主要是通过保护剩余肝脏的功能，而非促进肝手术后剩余肝脏组织再生（2），此结果在本领域里填补了空白。但AG490干预后剩余肝组织内促炎和抗炎细胞因子的变化，以及其细胞内作用的途径究竟是通过哪些信号转导蛋白来实现尚未明了，本研究的目的是最终从分子生物学层面上阐明AG490保护剩余肝脏功能的机制。

材料与方法
1．实验动物
Sprague-Dawley雄性大鼠，体重220g～270g，由中国医学科学院实验动物中心提供。动物在控制温度、湿度及12小时照明与12小时黑暗交替的环境中饲养，允许随时自由食用固定标准饲料和清水。
2．药品与器材
手术器械由北京协和医院外科和动物中心提供。
AG490购自Calbiochem公司(San Diego, CA, USA)，每5mg用5ml DMSO-15ml ddH2O充分溶解，每次注射1mg/kg BW。
3．实验分组
肝切除手术的大鼠（n＝38）随机分为2组。Ctrl组（n=10）：术后即时及术后每12小时腹腔内注射生理盐水1ml，直至死亡。 AG490组（n=28）：术后即时及术后12、24、36小时各腹腔内注射AG490溶液1ml (1mg·kg-1·12h-1)。

4．手术处理
大鼠90％肝切除：根据Emond等（3）的方法进行改良。上腹部正中切口，用丝线分别结扎外侧叶、中叶、右下叶及右上叶，并予切除。观察剩下的尾状叶无淤血后关腹。
5．标本采集
计手术关腹为零时，取时间点术后4、8、12、24小时及3-5天，取大鼠的剩余肝脏，液氮冰冻后置－70oC保存。
6． RNA的提取和半定量RT-PCR
RNA的提取：称取0.4g肝组织，在2ml Trizol（Lot 148609， Invitrogen Life Technology）中用电动匀浆机（Ultra-Turrax T25 basic, IKA-WERKE）于0oC、16000rpm匀浆30秒。用苯酚-氯仿反复提取后得少量RNA沉淀，干燥后以 30ml DEPC水溶解，取少量常规电泳（1％ Argarose）观察RNA质量。
半定量RT-PCR：由赛百盛生物公司合成IL-6及IL-10引物。以甘油三磷酸脱氢酶（GAPDH）为内对照，其引物由上海生工生物有限公司合成。取1.5 ml RNA，用Taq 酶扩增35个循环，产物经1.5％ Argarose电泳，结果用Doc 2000凝胶成像分析系统（Bio-RAD）的Quality 1 软件分析得PCR数值。
7． 蛋白的提取和Western Blotting（WB）
蛋白的提取：称取0.4g肝组织加入2ml裂解液中，用电动匀浆机于0 oC，16000rpm匀浆30秒后，在－4 oC以12000 x g离心20min后取上清为蛋白溶液。样品在分光光度计（Shimadzu，UV-1601）上测蛋白浓度以调整上样量。以b-Actin（一抗:Sc-1616 Goat-anti-actin1-19,中山生物有限公司；二抗：AP，Rabbit-anti-goat Ig G（H＋L），中山生物有限公司）为内对照。蛋白以SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上，分别用一抗（anti-phospho-Jak2 Tyr1007/1008，no.3771 和anti-phospho-Stat3 Tyr705，no.9131；Cell Signaling Technology）和二抗（AP,Goat anti-rabbit Ig G（H＋L），中山生物有限公司）孵育，化学发光法显色，用Doc 2000凝胶成像分析系统（Bio-RAD）的Quality 1 软件读取数据。
8．统计学方法
应用SPSS 11.0.0标准版(SPSS Inc.，USA) 统计软件进行统计。数据以Mean ± SEM来表达，经过Student-t检验后，以p<0.05为有显著意义的差异。

结果
（1）两组术后信号转导蛋白Jak2酪氨酸磷酸化程度的变化：术后4小时, Ctrl组和AG490组大鼠肝脏中磷酸化Jak2已到了能测及水平，但组间无差异。在此后的4小时内，Ctrl组水平迅速提升到原来的9倍，而此时AG490组的磷酸化Jak2被抑制到Ctrl组水平的40％（P<0.01）。到术后12小时AG490组的磷酸化Jak2水平几乎完全被抑制，同渐下降的Ctrl组水平有显著差异（P<0.01）。在此后的1～5天内存活大鼠中磷酸化Jak2仍有低水平表达（图1）。
（2）Jak2下游信号转导蛋白Stat3酪氨酸磷酸化程度的变化：术后4小时和8小时, Ctrl组和AG490组大鼠肝脏中磷酸化Stat3无显著差异。Ctrl组的磷酸化Stat3水平在术后12小时达到高峰，相应的AG490组水平被抑制到Ctrl组的40％，组间存在显著差异（P<0.01）。而其上游信号蛋白Jak2 8小时时已被显著地抑制。同Jak2相同，术后1～5天磷酸化Stat3仍有低水平表达（图2）。
（3）两组术后肝内促炎细胞因子IL-6的表达：术后8小时Ctrl组大鼠在创伤打击下肝脏IL-6表达水平达到最高，而应用AG490后其水平受到明显的抑制，两组有显著差异（P<0.01）。术后12小时Ctrl组的IL-6表达水平就较术后8小时明显下降，并与AG490组无显著差异。AG490组大鼠肝脏IL-6水平在术后12小时达到高峰，此后不断下降，在存活的大鼠中术后24小时已经达到比术后8小时更低的水平（图3）。
（4）两组术后肝内抗炎细胞因子IL-10的表达：术后8小时和12小时Ctrl组大鼠肝脏IL-10水平均很低，并与相同时间点的AG490组水平有显著差异，后者分别是前者的9～10倍左右（P<0.001）。AG490组大鼠肝脏IL-10水平在术后8小时和术后12小时维持在一个相当高的水平，直至术后24小时有显著下降（P<0.05），但仍比Ctrl组术后12小时的水平要高（图4）。
（5）两组术后IL-6/IL-10比值的变化：术后8小时和12小时Ctrl组大鼠肝脏IL-6/IL-10比值维持在8以上的较高水平，并均显著高于同时间点的AG490组大鼠（P<0.001）。AG490组大鼠的IL-6/IL-10比值在术后12小时最高，显著高于术后8小时（P<0.05），既使此时其值也低于2（图5）。

讨论
对于肝脏巨大占位患者，极限肝切除仍是有希望治愈的主要手段之一，但此种患者常合并肝硬化，手术后的高死亡率一直是困扰肝外科的一个难题。新近的看法越来越注意到，肝脏手术后过度的炎症反应所引起的剩余肝损害在术后转归上起到重要的作用（1，4）。我们此前的研究曾首先证明在大鼠90%肝切除的模型上，应用纯炎症阻断剂AG490能提高术后生存率（2），这可能同保护剩余肝功能的结果有关。本研究的结果从细胞内信号转导的层面上进一步揭示了AG490的分子生物学作用机理。
无论是手术和创伤均可能引起炎症级联反应（Inflammatory Cytokine Cascade），造成局部和全身的损害。各种细胞因子的释放均须通过细胞因子受体超家族的细胞内信号转导，其主要细胞内信号蛋白为Jak家族和Stat家族（5）。前者属于非受体型的酪氨酸蛋白激酶（PTK），由Jak1～3和Tyk2组成；而后者由7个成员：Stat1-4，Stat5a、5b和Stat6组成。它们的激活状态为酪氨酸的磷酸化形式（6）。AG490 [a-氰-（3，4-二羟基）-N-苄基肉桂酰胺]理论上是Jak2蛋白激酶的磷酸化抑制剂（7），目前尚未应用于临床。本实验结果证明了AG490对Jak2蛋白激酶磷酸化的强烈抑制，并且这种抑制在炎症反应的高峰期最明显的表现出来，这可能导致了前期实验中1/4动物存活的根本原因。我们研究了Jak2下游多条信号通路，观察到磷酸化Stat3蛋白的类似变化。略为不同的是Stat3位于Jak2的下游，故AG490对Stat3蛋白磷酸化的抑制可能是通过Jak2来完成，所以也比对Jak2蛋白激酶磷酸化的抑制要晚，到术后12小时才表现出来。在此后的1～5天内虽然这种抑制已基本去除，但它们却维持在一个较低的水平上。说明AG490的作用机制最根本在于抑制Jak2/Stat3的细胞内信号转导。
这种对细胞因子信号转导的抑制是否反映到细胞因子在剩余肝内的实质性表达呢？本实验又检查了肝内细胞因子IL-6和IL-10的表达。前者是较强的促炎细胞因子，它主要通过gp130/Jak/Stat途径促进炎症（8），而IL-10则是较强的抗炎性细胞因子。在本实验结果中，AG490对IL-6的作用在术后8小时最为明显，而对IL-10的影响在术后8小时和12小时都很显著。在AG490组中，尽管IL-6和IL-10都受到了正向的干预，但在术后8小时和12小时的水平都显著高于术后24小时的水平，说明炎症反应的一个高峰在于术后8小时到术后12小时，这是对抗炎症反应的关键时期；同时也说明AG490作为单纯的炎症抑制剂在本系列实验中的作用有其限度，无法达到实验动物半数以上的存活率，如果能对模型中给药方法/剂量加以改进并联合应用其他机理的药物，也许能达到更佳的效果。Ales等（9）提出用IL-6/IL-10比值来反应体内促炎性/抗炎性细胞因子的平衡，以此评估体内炎症反应的强弱程度，我们的研究结果同样显示了应用AG490后IL-6/IL-10比值同对照组相比有明显下降，其主要作用可能在术后8小时或8～12小时之间。
总之，本研究揭示了炎症阻断剂AG490通过有效抑制Jak2的酪氨酸磷酸化，进而阻止了Stat3的磷酸化，阻断或降低了细胞因子的细胞内信号转导。这种抑制在剩余肝内表现为促炎细胞因子表达的下降和抗炎细胞因子的增高。上述的分子生物学机理首次解释了AG490通过阻断炎症来保护肝切除后的剩余肝功能，从而有效地提高术后的存活率。此结果首先提出了极限肝切除术后对抗过度炎症的重要性的概念，为最终临床应用奠下了一定的理论依据。

志谢

中国医学科学院，中国协和医科大学基础医学院，生物化学与分子生物学教研室许彩民教授和袁建刚教授在本研究的设计和实施中给了极大的指导和帮助，并在本试验的基础研究部分提供了研究的条件和设备，在此深表谢意。

参考文献

于卓，毛一雷. 肝切除术后过度炎症反应的临床现状和进展. 中国实用外

科杂志，2004，24: 124-125.
2 毛一雷，于卓，桑新亭 等. 极限肝切除术后延长大鼠生存时间的研究. 中 华普通外科杂志，2004，19: 313-315.
3 Emond J, Capron-Laudereau M, Meriggi F, et al. Extent of hepatectomy in the rat. Eur Surg Res, 1989, 21: 251-259.
4 Yo-ichi Y, Mitsuo S, Takayuki H, et al. Effects of preoperative steroid administration on surgical stress in hepatic resection. Arch Surg, 2001, 136: 328-333.
5 Mao Y(毛一雷), Ling P-R, Fitzgibbons TP, et al. Endotoxin-induced inhibition of growth hormone receptor signaling in rat liver in Vivo. Endocrinology, 1999, 140: 5505-5515.
6 Kisseleva T, Bhattacharya S, Braunstein J, et al. Signaling through the JAK-STAT pathway: recent advances and future challenges. Gene, 2002, 285: 1-24.

Naftaly M, Tom G, Harjit D, et al. Inhibition of acute lymphoblastic leukemia

by a Jak2 inhibitor. Nature, 1996, 379: 645-648.

Peter CH, Iris B, Gerhard M-N, et al. Interleukin-6-type cytokine signaling through the gp130/Jak/Stat pathway. Biochem J, 1998, 334: 297-314.

Ales J, Neva P-L, Valentin S, et al. Balance of pro- and anti-inflammatory cytokines in liver surgery. Clin Chem Lab Med, 2003, 41: 899-903.