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文献进展
HBV 感染的治疗策略源自：丁香园
慢性乙型肝炎感染是一个主要的公共健康问题，在全世界范围内影响超过 2.4 亿人。虽然目前更新的抗病毒药物可使大部分患者体内的 HBV 复制受到抑制，但是，在 HBV 表面抗原消失或血清转换前停止药物治疗与大多数情况下的 HBV 复发相关。
因此，在缺乏有效治疗的情况下需要新的治疗模式来清除慢性感染患者体内的病毒。Rama Kapoor 教授等回顾了持续治愈或清除 HBV 病毒的新治疗策略。全文在线发表在 2014 年 9 月的 Future Virology 杂志上，现将内容编译如下。
一、前言
全世界范围内约有 2.4 亿人为慢性 HBV 感染（CHB）。目前的 HBV 治疗方法旨在达到抑制 HBV 复制水平低于检测下限。虽然这几乎可以在所有患者身上实现，但是长期的 HBV 治疗仍是一个挑战。无法获得持续的应答反应以及 HBV 持续存在与病毒因素和不充分的免疫反应诱导相关，这常见于急性 HBV 感染患者，其可自然地清除病毒感染。HLA 多态性也通过影响宿主对 HBV 感染的易感性来决定宿主免疫反应的多变性。
进一步了解 HBV 持续存在的机制指导了功能性治愈 HBV 感染治疗策略的发展。本篇文章中，作者讨论了正在研发中的针对病毒、宿主或两者兼而有之的以达到功能性治愈 HBV 感染的潜在治疗策略。这些干预措施中部分正在试验中，部分已经通过临床前验证，但是达到主动性临床试验的很少。
二、目前治疗慢性 HBV 感染的方法
目前 CHB 感染的治疗包括干扰素（IFN）或聚乙二醇干扰素α (PEG-IFN-α)，以及核苷 / 核苷酸（NA）为基础的治疗，后者包括拉米夫定（3TC）、阿德福伟、替比夫定、恩替卡韦和替诺福韦。CHB 患者进展至肝硬化和肝细胞癌（HCC）的风险增加。CHB 并发症目前已导致约 600,000 名患者死亡。目前 HBV 治疗的主要目标是延缓肝纤维化进展和降低 HCC 发生率。
长期随访研究显示，在 HBeAg 阳性、使用 PEG-IFN 伴或不伴 3TC 治疗获得持久病毒抑制的长期临床缓解患者中，其 HBsAg 血清转换率增高、肝组织学改善。基因型 A 或 B 的应答率也高于 C 或 D 型，且 A 和 B 型患者基线 HBV DNA 水平较低但 ALT 值较高。PEG-IFN 因其耐受性差和不良事件多而受到使用限制。
最初在美国获得批准的口服抗病毒药物（拉米夫定、阿德福伟和替比夫定）耐受性良好，但是耐药性的出现使其疗效有限。但是，更新的抗病毒药物（恩替卡韦和替诺福韦）抗病毒疗效更强、耐受性好，且耐药屏障高。长期随访研究表明，恩替卡韦和替诺福韦可获得持续的病毒学抑制以及在疾病的生物化学和组织学证据上有所改善。长期的抗病毒治疗也可延缓纤维化进展并减轻肝硬化程度。
经过 3 年的替诺福韦治疗，仅 8% 的 HBeAg 阳性患者出现 HBsAg 丢失。另一个研究也有类似的发现，使用恩替卡韦或拉米夫定治疗 HBeAg 阳性患者 2 年，HBsAg 丢失率分别为 5% 和 3%。尽管 CHB 治疗有极大的改善，但是目前的治疗仍有限制。
三、目前 HBV 治疗的缺点
1、慢性病毒抑制而无持续的治愈
目前抗病毒治疗的目标是抑制病毒复制。持续的病毒学抑制与临床预后改善有关，且已发现 HBV DNA 值增高强烈预示着进展至肝硬化和 HCC 的风险增加。在大部分患者中，目前的治疗没一个可达到 HBsAg 丢失或血清学转换。此外，现今的抗病毒治疗并不以保护性免疫反应和受感染肝细胞内持续存在的共价闭合环状 DNA（cccDNA）为靶目标。因此，目前治疗的目标是获得长久的病毒控制，因为清除 HBV 或“治愈”HBV 是不可能的。
2、耐药的出现
长期使用针对病毒聚合酶的抗病毒治疗（Nas）与选择性耐药突变相关。病毒聚合酶的改变也能产生 HBV 表面蛋白突变体，因病毒基因组有重叠的特性。耐药的出现阻碍了 NAs 的长期使用。
四、目前 HBV 治疗的终点
目前有几种评估治疗终点的标志，可分成生物化学、血清学、病毒学和组织学四种。所有应答可在治疗中和治疗后的几个时间点评估。
生物化学应答定义为 ALT 值正常。它可在治疗中、治疗结束时及治疗结束后的几个时间点进行评估。
病毒学终点定义为乙型肝炎病毒复制受到抑制，在治疗中及治疗完全结束后通过超敏 PCR 检测检测不到血清 HBV DNA。但是，这可能无法长久持续，有可能出现病毒再激活，所以这并不是一个明确的 HBV 清除标志。
HBeAg 的血清学应答仅适用于 HBeAg 阳性患者，其定义为 HBeAg 丢失并出现 anti-HBe 血清转换。HBsAg 血清学应答适用于所有 CHB 患者，其定义为 HBsAg 丢失、anti-HBs 产生。HBsAg 丢失、有或无 anti-HBs 产生是至今最有价值的治疗终点替代标志。HBsAg 丢失与肝硬化及 HCC 等并发症的预防有密切关系。
组织学应答定义为与治疗前组织学检查相比炎症活动减少（HAI 或 Ishak’评分降低 2 个点）或者肝纤维化无恶化。
五、HBV 清除或持续治愈是什么意思？
尽管使用新药物治疗 CHB 感染获得极大的改善，但是在治疗结束后仍会出现典型的病毒复制反弹。因此，现今的治疗仍不可能获得彻底的清除或治愈。合理的解释是在病毒持续存在和再激活中起到关键作用的 cccDNA 的存在。核苷类似物治疗可阻止 cccDNA 的进一步形成，但是对已存在的 cccDNA 无效。
理想的 HBV 清除可定义为 HBsAg 丢失并出现 anti-HBs 血清转换及 HBV DNA 持续抑制。这也许可导致 cccDNA 耗竭或失活。只有在我们达到清除或根除 cccDNA 的状态时，HBsAg 才可作为转录活跃 cccDNA 水平的替代标志。已有多个研究发现 CHB 患者中转录活跃 cccDNA 与 HBsAg 水平有正相关关系。
六、HBV 持续存在的机制
了解 HBV 持续存在的机制对设计清除 HBV 病毒的治疗策略有重要作用。慢性 HBV 感染的特征是病毒复制与宿主免疫反应间相互作用。病毒和宿主因素均对 HBV 的持续存在起作用。病毒高效且独特的复制机制使用 cccDNA 作为转录模板，后者隐藏在细胞核内并通过固有的 DNA 传感细胞机制逃避检测。
另一个因素是作为耐受原的病毒蛋白（HBsAg 和 HBeAg）的产生，可导致 T 细胞耗竭。进一步了解 HBV 持续存在所涉及的机制有助于研发克服这些因素的治疗策略，可获得持续的病毒学抑制。
1、病毒因素
⑴病毒复制过程容易出错
HBV 为一小包膜 DNA 病毒，有独特的基因结构和复制机制。HIV 基因全长有 10,000bp，而 HBV 仅有 3200bp，其多个重叠的开放阅读框架（ORFs）可对 HBV 的突变施加更多的限制。
尽管受到 ORFs 施加的限制，HBV 复制仍是容易出错，因为其缺乏 HBV 聚合酶的校正功能（错误率 10−4 至 10−5），这可导致携带异质性病毒株基因序列池的累积，也称为准种。当其暴露于来自乙型肝炎免疫球蛋白的免疫压力、NAs 或疫苗等多重选择压力下时，这些病毒突变体有强大的生存优势。
⑵Precore/core 突变
病毒核心 mRNA 编码核心蛋白（主要的核衣壳蛋白）和 DNA 聚合酶（用于逆转录 RNA 前基因组），并充当前基因组 RNA，后者为逆转录的模板。前核心 mRNA 编码前核心蛋白（在内质网中处理产生 HBeAg）、基础核心基因启动子（BCP，核苷酸 1744-1804，位于 X ORF，控制前 C 区和 C 区的转录活动）。目前已报道有多中前核心和核心区突变。
研究比较充分的前核心突变有：位于 nt1896 的终止密码子突变，可导致 HBeAg 表达的终止；位于 nt1762 和 nt1764 BCP 处的突变，可导致 HBeAg 产生减少、宿主免疫应答增强。这些突变导致 HBeAg 阴性 CHB 患者的出现。前核心突变和致病性增加间的关系已被描述。
早期研究发现，前核心突变可能与重症慢性肝脏疾病及急性肝衰竭相关。患者体内检测到前核心或 BCP 突变，其应答的可能性较低，也不是 PEG-IFN 治疗的最佳适宜者。有报道 BCP nt1762 和 nt1764 处双突变与重症肝脏疾病、爆发性肝炎、肝硬化和 HCC 相关。
⑶HBV 基因型
HBV 基因型解释了世界各地慢性乙肝患者临床表现和治疗应答异质性的原因。有研究报道 HBV 基因型与临床预后和治疗应答有关系，尤其是在 IFN 治疗中。至今已发现 10 种 HBV 基因型（A-J）和数种基因亚型，分型依据是 HBV 全基因组序列和独特的地理分布。
基因型 A 是急性 HBV 感染后进展至慢性感染且持续存在的独立风险因子。基因型为 A、D 的急性 HBV 感染发展至慢性感染的机率高于 B 和 C 型。基因型 C 和 D 的患者自发性 HBeAg 血清转换率低于 A 型和 B 型。HBV 基因型与前 C 和 BCP 突变有明确的关系。基因型 C 有更高的频率出现 BCP A1762T/G1764A 双突变和前 -S 缺失，同时其病毒载量也高于基因型 B。
类似的，基因型 D 出现 BCP A1762T/G1764A 双突变的频率高于基因型 A。基因型 C 和 D 与严重的肝脏疾病如肝硬化和 HCC 有关。基因型 A 和 B 对干扰素治疗的应答反应优于 C 和 D 型，但对 NAs 的应答无差异。
⑷cccDNA
受感染肝细胞中 HBV 清除缓慢且持续存在的一个主要决定因素是 cccDNA 的存在。HBV 基因组以超螺旋结构的 cccDNA 形式存在，与组蛋白和作为微型染色体的 DNA 分子伴侣蛋白相关。这个形式使得 HBV 可持续存在于细胞核内，不受宿主天然免疫应答的干扰。而且，受感染肝细胞的半衰期长，使得 cccDNA 在感染细胞的细胞核内无定期的存在，作为病毒基因组复制再激活的储存器。
研究发现，耐药突变存在于 cccDNA 内，可在交叉耐药的药物作用下快速选择出现。每个细胞核内约存在 15-50 拷贝的 cccDNA，作为易出错病毒聚合酶产生的病毒逃避突变体的存储器。使用目前受批准的抗病毒药物治疗可抑制病毒复制，但是并不直接攻击 cccDNA。因此，失活或清除 cccDNA 是彻底根除 HBV 的潜在新治疗方法之一。
2、宿主因素
⑴宿主遗传。HBV 的持续存在和疾病预后的多样性也依赖于多种宿主因素。个人的 HLA 型是决定宿主对 HBV 免疫反应多态性的重要因素。全基因组关联研究的证据表明 HLA DRB 等位基因点 DRref-1*1301/2 与感染的自发性缓解相关，但是 HLA-DR7 (DRref-1*07) 和 HLA-DR3 (DRref-1*0301) 与慢性 HBV 的易感性增高相关。
其它与慢性感染风险相关的还有 HLA-DPA1(*)0202-DPref-1(*)0501 和 HLA-DPA1(*)0202-DPref-1(*)0301。 HLA-DRref-1*0701 和 DRref-1*0301 不仅与慢性 HBV 感染的易感性增高有关，还与 HBsAg 疫苗无应答相关。其它与无应答或弱应答反应相关的等位基因包括 DRref-1*03, DRref-1*07, DQref-1*02 和 DPref-1*1101。HLA- DRref-1*0901, DQA1*0301, DQA1*0501 和 DQref-1*0301 与 HBV 在不同种族患者中的持续存在有联系。
目前已明确这种基因型通过允许更多的蛋白泛宿主结合至此等位基因来影响宿主反应，导致在带有此有利等位基因的患者上有更广泛的 T 细胞反应，从而使感染自限化。另一研究 CHB 患者同胞的全基因关联研究发现，21 号染色体上横跨 IFN-α 受体 II 和 IL-10 受体 II 的单个核苷酸多态性的连锁区与慢性感染相关。
⑵宿主 - 病毒相互作用
与急性 HBV 感染恢复的患者相比，CHB 患者对 HBV 的适应性免疫应答要弱。研究已证实这些患者中对 HBV 抗原做出应答的 T 细胞有衰竭表型，对 HBV 抗原应答要弱。而且，已发现 HBV 抗原通过特异性地阻碍 Toll 样受体（TLR）2、7 和 9 分子的信号干扰固有免疫识别。这些分子在产生有效的先天性适应性串联反应中起重要作用，这一串联反应是有效的抗 HBV 免疫反应中的基石。
七、获得持续病毒学抑制的新策略
1、以病毒为靶目标
⑴以病毒进入为靶目标。HBV 为包膜病毒，专性感染肝细胞。病毒通过病毒膜蛋白与细胞受体间的特定相互作用进入肝细胞。以病毒进入细胞为靶目标的受体拮抗剂给我们提供了一种治疗 HBV 的新方法。最近，使用树鼩的原代肝细胞进行的体外研究报道了 HBV 的功能性受体 ---- 牛磺胆酸钠共同转运多肽（NTCP）。NTCP 为牛磺胆酸钠依赖转运蛋白，分布在肝细胞的基底外侧膜，负责肝细胞内大部分的 Na+- 依赖胆汁酸摄取。
在这点上，来源于 HBV 包膜蛋白 pre-S1 区、可特异性针对 NTCP 的合成脂肽 Myrcludex-B，在体外及感染 HBV 的人肝细胞重构的 uPA/SCID 小鼠中展现出有效的阻抗 HBV 感染的能力。一项对比 CHB 患者中多剂量 Myrcludex-B 及接受 NAs 标准治疗的安全性、耐受性及疗效性的 III 期临床研究最近已经完成，结果尚未公布。
⑵以病毒组装 / 包装为靶目标。HBV 的持续存在及传播需要 HBV 复制，这取决于核心颗粒的组装。核心颗粒由衣壳蛋白、多聚酶、前基因组 RNA 组成。病毒组装是病毒复制中一个关键步骤，这可成为治疗的一个诱人靶点。
目前已发现多种可异常调节或抑制病毒组装和包装的复合物。Bay 41-4109 为研究最深入的异芳香双氢嘧啶复合物中的其中一个，可抑制衣壳形成、缩短核心蛋白的半衰期。这些药物通过诱导不适合的组装抑制病毒复制，同时，当病毒组装过多时，通过误导组装降低正常衣壳的稳定性。这些复合物对 NAs 耐药的 HBV 突变也有抑制活性。
类似的，phenylpropenamides 也能抑制病毒包装，活性对抗 3TC 耐药病毒株。Phenylpropenamides 诱导 HBV 病毒衣壳的 3 级和 4 级结构改变。已发现 AT-130（phenylpropenamides 派生物）结合至二聚体接触面的泛宿主口袋（为衣壳上一个独特的结合点），可作为有效的抗病毒药物。它通过及时地诱导病毒在错误的位点开始组装从而产生外壳形态正常但实际为无感染的空病毒来减少病毒的产生。这些复合物的临床疗效还未报道，需继续研究。
⑶以 HBsAg 的分泌为靶目标。HBV 之所以持续存在，主要是因为抵抗病毒的免疫反应无效。HBV 逃避免疫的确切机制目前知道的很少。病毒感染的初始反应激活了固有免疫反应，如 I 型 IFNs（(IFN-α 和 IFN-β) 的产生。
有关已感染 HBV 黑猩猩的研究证实，I 型 IFN 产物和 IFN 反应在感染的早期阶段已经完全缺失。最近的研究表明，急性 HBV 患者中也缺乏 I 型 IFN 反应。从这个观点看，急性 HBV 感染早期阶段以 IL-10 产物为特征，而不是 I 型 IFN，同时自然杀伤细胞（NK 细胞）和 T 细胞反应暂时性减弱。固有免疫的抑制也通过 HBV 抗原直接干扰宿主细胞调节。
已发现 HBV 感染患者中 HBsAg 高达 400ug/ml（总血清蛋白的 0.4%），这被认为在抑制 HBV 特异性免疫反应中起重要作用。新近的研究提出，HBsAg 直接作用于树突状细胞限制细胞因子的产生。因此，控制 HBsAg 的分泌或许能确保治疗性疫苗的使用或者与 NAs 联合使用治疗 HBV。目前已经在研究几种可降低 HBsAg 分泌的药物。
体外研究数据提示，非特异性抗微生物药 nitazoxanide 及其活性代谢物 tizoxanide 以剂量依赖方式降低细胞外 HBsAg、HBeAg 以及细胞内 HBcAg。Nitazoxanide 在细胞培养中对细胞内 HBV 复制及细胞外病毒的产生表现出选择性抑制作用，与拉米夫定或阿德福韦酯联合抗 HBV 时起协同作用。
最近，通过高通量筛选，使用表达 HBV 的细胞系 HepG2.2.15 识别出了一系列抑制 HBsAg 分泌的新三唑嘧啶抑制剂。母体化合物并不是病毒基因复制的抑制剂，而是针对 HBV 包膜分泌的特异性抑制剂。这些三唑嘧啶衍生物在抑制对 NAs 药物耐药的 HBV 变异体的 HBsAg 分泌上也有活性作用。这些复合物作用的确切机制仍在研究当中。目前仍不清楚 HBsAg 分泌减少是否能提高体内 HBV 特异性免疫。
HBV 基因组为非常紧凑的结构（约 3 Kb），包括四个重叠的 ORFs 编码区，编码病毒聚合酶 / 逆转录酶区、衣壳形成核心蛋白、3 种包膜蛋白（分别称为大、中、小乙型肝炎表面抗原）和调节性 X 蛋白。
HBV 病毒子为双壳球形结构，内为核衣壳、外为脂蛋白包膜。除了感染性病毒子外，HBV 产生另外两种颗粒（亚病毒空包膜颗粒和亚病毒裸露衣壳颗粒）。三种包膜蛋白以不同的比例存在于三种类型的 HBV 颗粒中。非感染性亚病毒颗粒（SVPs）有共同的病毒包膜抗原特征，在免疫系统中大概起诱饵作用。过去认为感染性病毒颗粒的出芽取决于多囊体通路的作用。
核苷酸多聚体，兼性寡聚核苷酸目前正在 CHB 患者中进行概念验证试验。Rep 9AC’阻断 HBsAg SVPs 分泌，而不影响感染性病毒子的分泌（与最近的研究一致，表明 SVPs 和感染性病毒子使用不同的通路出芽）。使用 REP 9AC'（核苷
酸多聚体）治疗的患者其 HBsAg 从血清中清除，部分患者获得血清转换。更新的暂时性结果已在荷兰阿姆斯特丹举行的第 49 届欧洲肝病研究协会的年会上展示。
使用 REP 9AC' 单药治疗获得 HBsAg 血清清除的患者经受了 REP 9AC' 与 PEG-IFN 或胸腺素 -α的联合治疗（混合了免疫调节活动）。在联合治疗中所有患者均观察到 anti-HBs 抗体增加。关于这个试验的进一步更新还在等待中。
⑷以包膜为靶目标。三种 HBV 包膜蛋白有共同的 S 区，在 S 区的 146 位氨基酸 N 端有糖基化。MHBs 和 LHBs 包含有 pre-S2 区，LHBs 蛋白的 N 末端包含 pre-S1 区。包含有 HBV 基因组的乙型肝炎核心颗粒的包膜（核衣壳）取决于胞液侧非糖基化 pre-S 序列与核心颗粒确定区域的相互作用。包膜病毒颗粒及 SVPs 颗粒的转运实际上可能依赖于糖基化和病毒 MHBs 糖化蛋白的处理。
葡萄糖苷酶抑制剂抑制病毒的形态发生和传染性，很可能是通过抑制内质网膜上包膜蛋白的糖基化。这一方法对于破坏 HBV 包膜的发育很重要，从而产生准种，其结合靶细胞和产生感染性的能力是有缺陷的。这是另外一种以 HBV 为靶目标的有前景的方法。
⑸以 cccDNA 为靶目标。现今基于 NA 的治疗方法可阻止新 cccDNA 的复制和形成，但是感染细胞中已存在的 cccDNA 并不受现今治疗的直接影响，且其半衰期长（33-50 天）。细胞核内的病毒 cccDNA 为病毒逃避突变体的储存器，后者是由易出错病毒多聚酶及具有耐药性能逃避突变体产生的，这可引起药物耐药或在中止治疗后出现病毒反弹。
a、cccDNA 的失活、清除或降解。新近研究的一种治疗方法通过使用锌指核酸酶（ZFNs）直接以细胞内的 HBV cccDNA 为靶点。锌指蛋白能阻止 cccDNA 的转录。已证明 ZFNs 是近些年来最万能和有效的靶基因药物之一。ZFNs 分成 DNA 结合区和 DNA 切割区。
体外证据表明 ZFPs 可特异性地针对鸭 HBV 感染模型中的 cccDNA，抑制病毒转录和复制。正在经历 DHBV 病毒生命周期的 LMH 细胞中，ZFPs 的表达导致病毒 RNA 和蛋白的表达下降，且无任何明显的毒副作用，而空白载体对照中无下降。此外，在表达性的 ZFPs 存在下病毒颗粒产生减少。
ZFNs 能在体外肝癌细胞系中切割 HBV DNA。但是，它增加了脱靶效应和特异性传递 ZFNs 进入受感染个体肝脏中的临床挑战。这个挑战可通过应用传递载体平台来克服。使用腺相关病毒作为载体平台的研究正在探索将设计者的核酸酶传递入靶细胞。腺相关病毒载体在临床和临床前应用中也发现是安全的。
最近 Cai 等识别了两种结构相关的双取代磺胺类药（DSS），命名为 CCC-0975 和 CCC-0346，已确认为抑制 cccDNA 产生的抑制剂，细胞培养中其 EC50 量低。作者已证实 DSS 能同时降低 HBV cccDNA 和其公认的前体 - 脱蛋白松弛环状 DNA（DP-rcDNA），不直接抑制细胞培养中的 HBV DNA 复制或者降低病毒多聚酶的活动。
但是，DSS 复合物并不促进细胞内 HBV DP-rcDNA 和 cccDNA 的衰减，这意味着复合物主要干扰了 rcDNA 转换成 cccDNA 这一过程。此外，CCC-0975 可减少鸭 HBV 感染模型中原代鸭肝细胞中的 cccDNA 的生物合成。
新近的另外一个研究表明，HBV cccDNA 依赖 APOBEC 降解是由感染 HBV 的分化的 HepaRGB（dHepaRG）细胞系和原代人肝细胞上的 IFN-α和淋巴毒素 -β 受体所诱导的。HBV 核心蛋白调节核 cccDNA 间的相互作用，导致胞嘧啶脱氨基、脱嘌呤 / 脱嘧啶位点形成并最终导致阻止 HBV 再激活的 cccDNA 降解。
b、cccDNA 的表观沉默。另一种针对 cccDNA 的方法是通过表观沉默或转录阻遏实施。有证据表明在细胞培养和人源化小鼠中 IFN-α可表观沉默 cccDNA。已发现 IFN-α通过靶向 cccDNA 功能和转录的表观控制来抑制 HBV 复制。
c、以病毒 mRNA 为靶目标。使用反义寡核苷酸、核糖酶或 RNAi 能直接靶向病毒 mRNA。体外数据显示 HBV 转录水平可通过使用反义寡核苷酸、发夹状核糖酶或使用慢病毒载体进行传递的锤头状核糖酶降低。
RNAi 是现代生物技术中进展最快的领域之一。RNAi 是小干扰 RNA 分子在转录后水平诱导基因沉默，有效敲除感兴趣基因的表达。在哺乳动物细胞中，它可特异性地以细胞 mRNA 的降解为靶点。由于 ORFs 在 HBV DNA 基因组中广泛使用，多种 HBV RNA 使得病毒易受 RNAi 影响。多个研究表明，在细胞培养和小鼠模型中病毒 mRNA 和 HBV 复制可被 RNAi 抑制。
McCaffrey 等表示 RNAi 可应用至细胞培养和转染了 HBV 质粒的有免疫活性或免疫缺陷的小鼠中抑制 HBV 复制中间体的产生。RNAi 能抑制在细胞培养和小鼠模型中出现的所有 HBV 复制步骤。
他们发现了四种不同类型的证据证明在小鼠模型中 RNAi 能充分地抑制 HBV：RNAi 的表达明显地降低血清中分泌的 HBsAg；小鼠肝脏中 HBV RNA 极大地减少；小鼠肝脏中 HBV 基因组 DNA 减少至检测不到的水平；以及 HBV 核心抗原（HBcAg）着色细胞数也极大的减少。
RNAi 可作为新的治疗方法，但是仍有多个挑战存在，如体内有效的传递、RNA 不稳定以及脱靶效应等，这些都需要在它应用至 CHB 患者的治疗前克服。
2、以宿主为靶目标
从急性 HBV 感染中恢复与强壮的天然和适应性免疫反应有关。天然免疫应答是对抗病毒感染的第一道防线，可产生 I 型 IFN，后者可抑制病毒复制、调节 NK 细胞杀伤病毒感染细胞，并通过产生促炎症细胞因子和趋化因子支持适应性免疫的有效成熟和位点募集。
I 型 IFN 的主要产生者为浆细胞样树突状细胞（pDC），pDC 主要通过 TLR7 和 TLR9 两种细胞内 TLR 病原体相关分子模式的识别对病毒和其他病原体做出应答反应。触发 TLR 能激活 pDC、产生大量的 I 型 IFN，以及释放其他细胞因子，包括 TNF-α、IL-6 和细胞表面共刺激分子。pDC 也激活 NK 细胞和 T 淋巴细胞，进一步致敏和调节抗病毒免疫力。
适应性免疫系统的有效致敏引起不同 B 细胞和 T 细胞克隆的功能性成熟和表达，这能特异性地识别感染性抗原。这一步骤使感染得到控制并产生记忆应答。记忆应答能提高宿主阻止后续相同病原体感染的能力。
在 CHB 患者中，HBV 与天然免疫和适应性免疫应答迟钝有关。因此，放大天然免疫应答的治疗策略也许能提高适应性抗 HBV 免疫力。数个研究已经证实，CHB 患者中 TLR 的表达（TLR 2, TLR 3, TLR4, TLR7 和 TLR9）降低。就这点而言，HBV 能干扰 TLR2、7 和 9 的信号，而这些信号在控制感染和清除病毒感染细胞中被认为占据有重要作用。
⑴TLR 拮抗剂。研究发现，当 HBV 转基因小鼠注射特异性针对 TLR2-9 的配体时，这些小鼠的肝脏产生 IFN-α、 -β 和 -γ 抑制 HBV 复制，这意味着 HBV 的复制能通过激活肝脏中的固有免疫应答来控制。抑制 HBV 复制通过在转录后水平抑制病毒组装或含 HBV RNA 质粒的稳定性来完成。这些证明了 TLR 的激活能直接抑制 HBV 复制。
但是，HBV 总会逃避 TLRs 的固有识别，通过其能力逃避固有免疫应答，干扰 TLR 的表达并抑制 TLR 信号级联反应。有报道称肝细胞和其他细胞中 TLRs 的表达在不同 HBV 病毒产物存在时下调。虽然 HBV 绕行内源性 I 型 IFN 信号通路，但是使用外源性 IFN 诱导使用 TLR7 激动剂也许能恢复 IFN-α反应。当联合使用可最大程度抑制 HBV 复制的策略，即体内使用 NAs 和通过 TLR 激动剂诱导外源性 IFN 刺激联合也许能产生保护性免疫力。
研究表明，使用 NA 长期抑制 HBV 部分性地重建了适应性免疫。就这点而言，使用 TLR 激动剂辅助治疗也许能加速免疫重建和 HBV 清除的过程。
首先，TLR 激动剂作为口服复合物能快速被肝脏摄取。其次，它们也许能与其他 NAs 合成在一片药片中联合作用。最后，与注射 IFN 相似，TLR 激动剂诱导 IFN 产生，触发细胞因子合成以促进细胞内的通讯和细胞运输。但是，通过使用 TLR 激动剂能在肝脏中诱导抗病毒状态，清除与系统性固有免疫激活相关的不良事件。
Lanford 等通过一种口服 TLR-7 激动剂 GS-9620 在慢性感染 HBV 的黑猩猩中研究免疫激活的效应。黑猩猩每两天喂一次 GS-9620（1mg/kg），连续四周后休息一周，然后再以 2mg/kg 的剂量服药 4 周。TLR-7 激动剂在血清和肝脏中对 HBV DNA 的抑制均延长。服用 GS-9620 诱导产生 IFN-α、不同的细胞因子以及趋化因子。
此外，它激活了所有的淋巴细胞亚集，诱导干扰素刺激基因（ISGs）。血清中的 HBV DNA、 HBsAg、HBeAg 降低 以及 HBV 抗原阳性肝细胞减少。但是，在肝细胞内及血清病毒载量减少期间，肝脏中的酶以及免疫细胞通透性增加。
在健康志愿者中探索口服 GS-9620 的安全性、耐受性、药物代谢动力学和药效学的早期研究中，口服剂量（单次剂量为 0.3, 1, 2, 3, 4, 6, 8 或 12 mg）吸收良好，耐受性可。与 IFN 治疗相关的不良事件出现在接受 8 或 12mg 剂量的患者中，血清 IFN-α仅在这些剂量中发现，虽然 TLR 激活或 ISGs 在剂量 ≥2 mg 时可观察到。
在 CHB 患者中进行的两项 GS-9620 I 期临床试验已经完成。其中一个在病毒学抑制的 CHB 患者中进行，另一个在 CHB 初治患者中进行。这两个试验的结果很吸引人兴趣。
⑵细胞因子。使用细胞因子作为慢性病毒感染的免疫调节治疗目前已被广泛研究。可能有利于 CHB 患者的指标是 IL-7 和 IL-21。
a、IL-7。IL-7 对原始 T 细胞的发育极为重要，可能在正常的 B 细胞发育过程中起重要作用。DC 细胞中 IL-7 调节信号可调节外周 CD4+T 细胞的动态平衡。IL-7 治疗 CHB 患者是提高、恢复和修复对抗 HBV 的免疫反应。多个模型体系的临床前数据表明，IL-7 在过继性细胞治疗中有强大的免疫恢复效应、疫苗辅助效应以及有益效应。
CYT107 是由 Cytheris SA 使用重组哺乳动物细胞培养体系制造的第二代重组人 IL-7 产物。一项对 HBeAg 阴性 CHB 患者重复给予重组人 IL-7（CYT107）、同时联合使用标准抗病毒治疗和疫苗的随机、对照、开放标签、剂量递增 I/II 期临床试验正在进行。
b、IL-21。IL-21 在诱导和维持效应 CD8+T 细胞上起重要的调节作用。多个在小鼠中进行的关于慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染的研究表明，维持效应 CD8+T 细胞功能池需要 IL-21 的信号作用。IL-21 或 IL-21R 缺陷小鼠其病毒特异性多功能效应 CD8+T 细胞的数量进行性减少，这与控制病毒能力弱有关。在 CHB 感染中，IL-21 对促进小鼠控制感染的免疫应答起重要作用。
一项有关 CHB 患者的纵向研究发现，进行抗病毒治疗并获得完全病毒学抑制的患者其血清 IL-21 水平高于未治疗患者。血清 IL-21 浓度高也是 HBeAg 出现血清学转换的一个预测因子，这是一个与 HBV 感染得到控制相关的重要的临床预后。重组 IL-21 是一个新型的免疫调节剂，目前正在癌症患者中进行 I 和 II 期测试。使用重组 IL-21 联合 NAs 治疗 CHB 可能是一种有前景的方法。
c、程序性死亡分子 -1（PD-1）或程序性死亡配体 -1。慢性和持续性 HBV 感染与免疫反应弱或免疫反应功能受损有关。持续暴露于病毒抗原导致病毒特异性 CD4 和 CD8 细胞功能失调或缺失，暴露时间延长可导致 T 细胞反应耗竭。
最近的数据表明，病毒特异性 T 细胞过表达 PD-1 分子，淋巴细胞上的 PD-1 受体与其程序性死亡配体 1/2（PD-L1/2）间的相互作用在 T 细胞耗竭中起重要作用。体内外数据发现，PD-1/PD-L1/2 配体阻止 PD-1 与其配体 PD-L1/2 结合，而抑制 PD-1/PD-L1/2 配体能提高特异性 T 细胞的抗病毒能力。
研究发现，HBV 特异性 T 细胞比其它 T 细胞更高水平表达 PD-1，并具有由细胞因子分泌决定的耗竭能力。现在正努力尝试在体外逆转 PD-1-PD-L 的相互作用以恢复 HBV 特异性免疫。在这一方面，在慢性感染 WHV 的土拨鼠肝炎模型上体外阻断 PD-1/PD-L1 发现 T 细胞的功能得到恢复。
而且，在持续感染 WHV 的土拨鼠体内阻断 PD-1/PD-L1 以及联合治疗性疫苗和 NA 抗病毒治疗发现这一联合作用诱发强有力的抗病毒效应，同时土拨鼠肝炎核心抗原特异性 CD8+T 细胞的功能得到改善。
Fisicaro 等在 CHB 患者中验证了慢性 HBV 感染发生机制中 T 细胞耗竭的作用。他们比较了肝细胞内和循环血液中 HBV 特异性 T 细胞的表型及功能，以及阻断 PD-1/PD-L1 的效应。研究结果发现，肝内 HBV 特异性 CD8 细胞高表达 PD-1，低表达 IL-7 受体 CD127。阻断 PD-1/PD-L1 可使外周及肝内的 T 细胞恢复，而且肝内 T 细胞的功能得到更好的改善。
有研究对晚期癌症患者静脉内的 PD-1 和 PD-L1 抗体进行了检测。抗体介导的 PD-L1 阻断可诱导持久的肿瘤消退，并延长晚期癌症患者中疾病的稳定性。但是，使用 anti-PD-1 抗体会导致相当高频率的 3 级或 4 级不良事件发生（不良事件约在 14% 的患者中出现，其中 3 名患者死于肺毒性）。
阻断 PD-1 作为 CHB 患者的一种治疗模式正在研究当中。这种方法比较独特，为 CHB 感染中耗竭性 T 细胞的复活提供了很好的机遇，从而使得抵抗 HBV 的适应性免疫得以恢复，并有很大的机会获得持续病毒学抑制。使用任何一种阻断中央免疫调节机制的方法都会有未知的并发症。这就构成了一定的风险，可能不被其他健康的 CHB 患者所接受，除了终末期癌症患者。
使用 anti-PD-1 抗体治疗能提供最大的希望阻断 PD-1/L12 的作用，因为 PD-L1 阻断仍会允许 PD-1–PDL2 作用，但是 anti-PD-1 抗体与大部分不良事件相关，在其作为 CHB 的治疗药物前可能需要更进一步的研究。
d、调节性 T 细胞。调节性 T 细胞（Treg）由不同的 T 细胞亚群组成，包括自然发生 CD4+ CD25+ Tregs，诱导型 Tregs（产 IL-10 CD4+ I 型 Tregs（Tr1）和 T 辅助 III 型细胞），以及从 CD4+ CD25- 转换而来在外周血中发育的 CD4+CD25+T 细胞。实验性数据表明，循环 CD4+CD25+Tregs 或许能抑制 CHB 患者中的 HBV 特异性 T 细胞应答，从而导致 HBV 持续存在。
尽管观察到上述现象，但是一个在感染 WHV 土拨鼠中进行的使用 IL-12 联合 TGF-β抑制肽或 Treg 耗尽的研究发现，TGF-β抑制或 Treg 耗竭并没有抗病毒效应，反而观察到肝内耐受原环境得到改善。由于 Treg 没有独特的表型特征作为靶点，所以在体内干扰 Treg 的功能会变得很困难。
⑶治疗性疫苗。治疗性疫苗是一种有发展前景的清除 HBV 的治疗方法。正如前面所述，由持续性抗原刺激所致的 HBV 特异性 T 细胞耗竭在 HBV 持续存在或慢性化中是一个主要的决定因素。治疗性疫苗可诱导强有力的 CD4+T 细胞应答、中和免疫耐受、激活液体免疫应答，以及刺激直接抵抗一种或多种 HBV 抗原的 CD8+T 细胞，最终达到持续控制 CHB 感染的目标。过去几年，不同的治疗性疫苗被研发，并在 CHB 患者中进行试验，获得了不同的临床预后。
数种针对 CHB 感染的治疗性疫苗正在研发当中，包括：基于重组 HBV 蛋白、HBV 包膜亚病毒颗粒、裸露 DNA 并最终与病毒载体联合的疫苗，以及基于不同 HBV 蛋白的 T 细胞肽表位的疫苗。
早期的经典疫苗以 HBsAg 蛋白为基础，后者预防性作用很突出。但是这些疫苗无法达到期望的治疗效果。传统的基于 HBsAg 的预防性疫苗的抗病毒效应很短暂，并不能达到持续的病毒抑制。可能原因是大部分 CHB 患者由于 T 细胞应答耗竭而对 HBV 的应答反应减弱、对经典的免疫接种无应答。
a、基于重组 HBV 蛋白或 HBV 包膜亚病毒颗粒的治疗性疫苗
免疫原性复合物：一项基于抗原 - 抗体免疫复合物（HBsAg 与 anti-HBs 免疫球蛋白）的治疗性 HBV 疫苗的双盲、安慰剂对照 IIb 临床试验在 242 名 CHB 患者上进行，研究发现了临床和病毒学疗效的一些原始证据。这些患者接受靶向 DCs 的抗原 - 抗体免疫复合物疫苗注射。此联合作用的理论依据是基于搭载免疫复合物的 DCs 在致敏 HBV 特异性 CD8+ 细胞毒性 T 细胞应答效率上优于自然发生免疫复合物这一假设。
但是， III 期临床试验结果无法体现出基于免疫复合物疫苗的治疗疗效。
HBsAg 和 HBcAg 组合。另一种方法涉及鼻腔 HBV 疫苗，其以 HBsAg 和 HBcAg 作为疫苗抗原。鼻腔 HBV 疫苗以临床前研究结果为基础，后者在试验中有良好的免疫原性和安全范围。重组 HBcAg 可作为 HBsAg 强有力的 Th1 佐剂以及强免疫原。这已在一个随机双盲、安慰剂对照的 I 期临床试验健康志愿者中进行了检测，试验结果表明此组合方法安全并有免疫疗效。
目前，一项基于 HBsAg/HbcAg 组合疫苗的 III 期临床试验正在进行中，此疫苗在 CHB 患者中以鼻腔和皮下注射方式给药，结果尚在等待中。
基于重组酵母的治疗性疫苗：以酵母菌为基础的免疫治疗平台 Tarmogens（以分子免疫原为靶向）正在研发当中。Tarmogens 整合了多种病毒抗原，表达性 HBV X、表面抗原（S）和核心抗原（X-S-core），在健康和 CHB 患者体外能诱导 CD4+ 和 CD8+T 细胞应答。
GS-4774 为一种 tarmogen，由整个热灭活重组酵母属啤酒酵母菌组成，而后者可进行基因修饰从而表达 HBV 抗原。使用整个酵母菌可使病原体更好地被树突状细胞摄取或处理，以将 HBV 抗原呈递给 T 细胞，与使用亚单位疫苗所致的主导性体液免疫相比，理论上其可导致更有效的细胞免疫。
Guo 等发现，使用上述备选疫苗免疫的小鼠可产生抗原特异性 T 细胞反应。此外，数据提示，GS 4774 (X-S core) 可明显地保护小鼠免受表达 HBV 抗原的肿瘤侵袭。Kemmler 等人所进行的第二项研究发现， tarmogens 可在体外诱导样本产生 HBV 特异性 T 细胞反应，这些样本是从健康人和 CHB 患者收集而来的。
最近，鼠类和人类免疫原性模型被用来评估由疫苗所诱导产生的 HBV 抗原特异性 T 细胞应答的类型和强度。使用 表达 X-S-core 的酵母菌免疫的小鼠中发现了针对 X、S 和 core 的 T 细胞应答。CD4+ 和 CD8+T 细胞反应均可观察到。转导了 HBc18–27 和 HBs183–91 特异性 T 细胞受体的人 T 细胞在添加 X-S-core DCs 孵育后产生了 IFN-γ。
而且，从 CHB 患者中分离所得的外周血单个核细胞，或使用添加了 X-S-core 或相关产物（S-core）的同源性 DCs 进行 HBV 疫苗接种者中分离的外周血单个核细胞产生了显著的 HBV 抗原特异性 T 细胞扩增，这些 T 细胞拥有细胞溶解表型。这些数据提示，表达 X-S-core 的酵母菌产生功能性适应性免疫反应。这些治疗性疫苗在诱导 CHB 患者产生 HBV 特异性 T 细胞应答上似乎很有前景。
Tarmogen GS-4774 正在 CHB 患者身上与直接抗病毒药物联合使用，以明确联合用药是否能提高 HBsAg 的血清转换率。一个关于 GS-4774 的 I 期临床试验已经结束，评估 GS-4774 治疗病毒抑制状态 CHB 患者的疗效和安全性的 II 期随机、开放标签试验正在进行中。正在进行的 II 期试验将会明确以酵母菌为基础的疫苗是否会在这些患者感染普通酵母菌感染时导致不可预测的过敏不良反应。
基于腺病毒的治疗性疫苗。TG1050 是一种基于重组非复制性人腺病毒血清型 5、表达多种特异性 HBV 抗原（截短型核心抗原、修饰后的多聚酶和 HBsAg 区抗原）的治疗性疫苗。这些产物已经被设计来诱导 T 细胞重新合成或刺激能控制 HBV 复制和清除 HBV 的功能性 T 细胞增殖。
Perrine Martin 等进行的一个试验发现 TG1050 能在初次接受试验的小鼠中诱导高水平的针对核心、多聚酶和 HBsAg 区的 T 细胞。腺相关病毒耐受的小鼠模型中，仅注射一次 TG1050 能诱导产 IFN-γ,、TNF-α 和 IL-2 的功能性和持久性 T 细胞，后者可在脾和肝脏中发现而 ALT 正常。分析多剂量注射 TG1050 的免疫学和病毒学效应的研究正在进行。
b、基于 DNA 和 T 细胞肽表位的治疗性疫苗
DNA 疫苗。DNA 疫苗具有诱导 T 细胞应答的潜能。注射 DNA 疫苗可产生 CD4+ 和 CD8+ 细胞，以及带有 Th1 表型、分泌 IFN-γ的辅助细胞。DNA 疫苗不仅能激活 HBV 特异性 T 细胞应答，也能激活 NK 细胞。
一项使用包含有编码多种 HBV 蛋白的大部分 HBV 基因的 DNA 疫苗联合基因构建的 IL-12 DNA 的研究在 12 名使用 3T 抗病毒治疗的 CHB 携带者中进行。治疗结束和随访时在患者体内发现了可检测的 HBV 特异性的分泌 IFN-γ的 T 细胞反应。这些 I 型 T 细胞反应，特别是 CD4+ 记忆 T 细胞应答在治疗结束后仍可维持 40 天，并与病毒学应答相关。
T 细胞肽表位疫苗。在一个 I 期临床试验中，对健康志愿者注射了多表位疫苗，后者由编码一系列的与 16Th 表位相关的来源于 30 种 HBV 细胞毒性 T 细胞表位的 DNA 载体组成，其有望通过大量的 HLA 分子递呈抗原至 T 细胞。在健康志愿者中这种疫苗安全、耐受性良好。
c、联合治疗方法
慢性 HBV 感染与 HBV 复制存在和抗原负载所致的 T 细胞耗竭相关。在注射疫苗前使用抗病毒治疗降低病毒载量能提高疫苗疗效。研究表明，治疗性疫苗在治疗开始时使用到低 HBV DNA 病毒载量的患者上时更有效。新近的试验都是基于此方法。治疗性疫苗与抗病毒药物一起使用可诱导病毒复制和抗原负载受到抑制下的 T 细胞恢复，后者在耐受性的诱导中起重要作用。
八、总结和展望
由于现有的治疗并不能诱导持续的 HBV 病毒学抑制，我们需要采用新的治疗方法。为达到此目标， 需要以 HBV 在人类中建立慢性感染所需的各种因素为靶点进行研究。以病毒和宿主因素为靶目标的方法能提供更好的机会完成此目标。这一系列方法的安全性，尤其是针对宿主免疫反应方法的安全性仍未确定。
如果这些方法是安全的，那么他们能提供独特的、针对 HBV 蛋白的并最终产生保护性免疫力和控制 HBV 复制的治疗机遇。cccDNA 仍是一个重要的病毒靶点，这需要独特的针对性方法，体外研究已证明该方法有效。研发使每个感染细胞的 cccDNA 易于分解的传递体系仍是一个巨大的挑战。实际上，联合治疗方法将会是最适合、最有效和最有实用性的技术，其可使大部分 CHB 患者获得持续的病毒学抑制。